[发明专利]大体积颗粒样品中的病原体检测

说明书

相关申请

本申请要求2007年8月1日提交的美国临时申请号60/953,422、 2007年11月1日提交的美国临时申请号60/984,624、2007年12月 31日提交的美国临时申请号61/018,079和2008年5月21日提交的 美国临时申请号61/055,099的优先权。在此将所有上述引用的申请引 入以作参考。

技术领域

本申请涉及用于在大体积颗粒样品中检测病原体的试剂、方法和 设备。

背景技术

相关领域的描述

根据疾病控制中心(CDC)的最新估计，每年仅在美国内食源性病原 体就为76百万例食源性疾病、325,000例住院治疗和5,000例死亡的 病因。除了对人类的有害医学作用之外，由于医疗费用、丧失生产力、 产品召回和出口停止，这些食源性爆发具有有害的经济学效应。对于 某些食源性病原体USDA推荐零容忍政策，因为即使少量的病原体也可 以存活和引起食物中毒或甚至爆发。因此，需要开发能够在食品样品 中检测甚至单一病原体的敏感的病原体检测技术。

为了检测食源性病原体目前可利用许多检测技术和产品，但是对 于在24小时时间范围内检测污染几克食品样品的单一病原体，仍然是 一个挑战。通常，病原体通过稀释和匀质化从食品样品中提取，导致 样品体积多达几百mL，或甚至更大。为了在大体积样品中检测少量病 原体，需要培养细胞直至病原体浓度达到适合病原体检测检验的水平。 所需的预富集时间依赖于倍增时间(doubling time)、靶病原体的活 力、检测所需的病原体浓度。预富集通常花费至少12至48小时。因 此，即使使用高敏感性检测检验例如聚合酶链反应(PCR)和酶联免疫吸 附检验(ELISA)，在食品样品中病原体污染的检测仍然需要1至2天。 此外，这些检验通常是昂贵的并且需要熟练的实验室人员。

此外，使用培养预富集的食品病原体检验需要处理富集的病原体， 其可能引起实验室和人员的二次污染。这样，这些检验不适合在食品 制造厂现场测试，而是可能需要例如在参考实验室处场外进行。同样 地，培养预富集将引起关于污染的食品病原体的定量信息的损失，这 是因为污染的病原体的活力和食品样品的成分可以影响病原体生长率 和因为样品多久达到细胞生长的稳定期或衰退期可能依赖于病原体的 污染水平。因此，使用预富集的食品病原体检验为非定量的并且评估 食品病原体污染的水平是困难的。

为了克服使用预富集的病原体检验的上述缺点，备选的富集方法 例如将大样品体积离心或过滤以增加病原体浓度可能是必要的。然而， 离心需要离心机，并且通常为繁琐的过程，特别是当大量的大体积样 品需要测试时。

过滤可以以更高通量进行并且可以浓缩在大体积样品中存在的甚 至少量病原体。为了浓缩病原体，过滤方法通常使用微滤(MF)膜过滤 器，其通常具有小于靶病原体的孔径。这样，病原体可以在此类过滤 器上浓缩并且通过几种检测方法检测，例如集落形成和DNA探针杂交。 然而，这些膜过滤器具有非常低的纳污能力并且由于其小孔径，倾向 于容易被颗粒食品提取物堵塞。这些过滤器适合用于包含较少颗粒的 样品，例如饮用或环境水，或适合于非常小体积的颗粒样品。具有合 适截留率的深度过滤器也用于捕获病原体；然而，在此类深度过滤器 中捕获的病原体的检测由于其三维基体结构(matrix structure)和过 滤器厚度而复杂化。

发明内容

本发明的实施方式涉及通过以下步骤的一步或多步在样品中检测 微生物的方法：

通过过滤器过滤所述样品，所述过滤器构造为吸引微生物并具有 构造为防止过滤期间堵塞的孔，以便微生物在所述过滤器中收集，

将聚合物和微生物检测试剂施加至所述过滤器；所述聚合物构造 为使微生物的生长局部化和/或防止微生物检测试剂的蒸发；

将所述过滤器温育对于使微生物生长至可检测水平而言足够的一 段时间；和

检测在样品中微生物的存在。