[发明专利]检测寡核苷酸的方法

说明书

发明领域

一般而言，本发明涉及对样品中经修饰的核酸寡核苷酸进行检测和/或定量的方法和组合物。这些方法和组合物可用于对生物样品中诊断性和/或治疗性的合成的经修饰的寡核苷酸加以检测和定量，所述寡核苷酸例如适配体、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)和其它非编码RNA(ncRNA)分子、反义寡核苷酸或核酶。

发明背景

在过去二三十年来，对特定核酸序列的鉴定和定量是分子生物学中人们极感兴趣的领域。对某些核酸及其产物进行鉴定和定量的能力令范围广范的多门学科(例如，个体化医学，包括分析单核苷酸多态性(SNPs)和评估药物抗性)取得进展，加深了我们对生物化学和分子生物学过程的理解，并且在癌症诊断和治疗方面有所进展，等等。

近来很多兴趣集中于某些非编码性的小RNA分子(特别是小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)及其前体)的新发现的性质和它们对细胞内过程的影响。目前人们相信，siRNA参与基因沉默，而miRNA被认为负责翻译阻遏(以及在某些情况下，基因沉默)的一些形式。随着对这些小RNA分子的兴趣极大高涨，科学家却面临对这些小分子进行鉴定和定量的困难任务。

siRNA是双链寡核苷酸，其长度典型地为19-23个核苷酸。它们可通过合成获得，可被化学修饰，并且目前被开发为潜在候选药物。此类分子的药理学性质仍待充分研究，这需要开发新的生物分析方法，在生物或临床样品中对它们加以检测和定量。

虽然过去十年对若干小RNA分子已有很多了解，但是仍有问题尚未阐明。它们的小尺寸可能带来问题，特别是对候选小RNA分子进行鉴定和证实有效的方面以及检测和定量小RNA分子的已知种类的方面。传统技术由于灵敏度方面的问题不足以满足这些需求。因此，人们需要开发更快更灵敏的方法来检测小RNA分子。

发明内容

本发明涉及对寡核苷酸分子进行快速检测和定量的组合物和方法，所述寡核苷酸分子例如短核酸，例如小干扰RNA和其它短核酸分子。本发明部分基于下述发现：对包含寡核苷酸结合区域的反转录引物的设计对灵敏度来说高度重要。本发明增加的灵敏度导致能够检测单个扩增分子。因此，本发明的方法和组合物提供了改进的、高度灵敏的方法，用于定量检测短RNA，例如但不限于脱氧核糖核苷酸构成的寡核苷酸和核糖核苷酸构成的寡核苷酸，包括但不限于，小RNA分子，例如非翻译功能性RNA、非编码RNA(ncRNA)、小非信使RNA(snmRNA)、siRNA、tRNA、微小非编码RNA(tncRNA)、小调节RNA(smRNA)、snoRNA、stRNA、snRNA、miRNA，其包括但不限于miRNA前体，例如初级miRNA(pri-miRNA)和前体miRNA(pre-miRNA)等(见，例如Eddy，NatureReviews Genetics 2：919-29，2001；Storz，Science 296：1260-63，2002；Buckingham，Horizon Symposia：Understanding the RNAissance：1-3，2003)。

因此，在一个方面，本发明涉及具有改进的灵敏度的、在样品中鉴定或定量寡核苷酸分子的方法，所述方法包括：将反转录引物与寡核苷酸分子杂交，其中，反转录引物包含具有寡核苷酸识别序列的寡核苷酸分子结合部分，所述序列包含位于3’区域与寡核苷酸分子的区域互补的至少2个核苷酸以及位于5’区域的包含至少2个核苷酸的延伸尾；用第一延伸酶延伸杂交的反转录引物，产生反转录产物；将正向引物与反转录产物杂交，其中正向引物包含寡核苷酸分子结合部分，所述部分包含与寡核苷酸分子的区域相同的至少2个核苷酸；用第二延伸酶延伸杂交的正向引物，产生第一扩增子；将反向引物与第一扩增子杂交；用第二延伸酶延伸杂交的反向引物，产生与第一扩增子互补的第二扩增子；检测扩增产物；以及由此对寡核苷酸分子进行鉴定或定量。该反应可以但不必须包含实时检测。在某些实施方式中，扩增步骤包含多路技术。

所述方法可用于快速检测和定量寡核苷酸分子，例如，小RNA分子、DNA分子、经修饰的RNA分子、经修饰的DNA分子、适配体、核酶、诱饵(decoy)寡核苷酸、免疫刺激性的寡核苷酸。寡核苷酸具有包含10-30个核苷酸的长度，它们可被化学修饰。寡核苷酸还可以是双链分子，例如siRNA。在另一方面，本发明提供了检测siRNA(其能通过RNAi抑制至少一种靶基因)的方法。本发明并不限于任何类型的siRNA或靶基因或核苷酸序列。例如，靶基因可以是细胞的基因、内源基因、病原体相关基因、病毒基因或癌基因。