[发明专利]表面柔软的多孔培养平板

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年8月30日递交的美国临时专利申请第60/969,104号的权利。

许可

政府根据合约NIH HL-82856、GM-073628享有本发明的某些权利。

背景技术

活细胞的物理环境影响了它的增殖能力、代谢能力、分化能力和改型。活细胞具有详细的表达谱系并表达不同的表现型和物理状态，对他们下面的支撑基质的硬度(即，刚性模量)具有非常灵敏的反应活性。

生物工程师和生命科学家普遍赞同的观点之一是，在很多情况下，刚性底物不适于评价细胞的生理行为。为了在三维立体重组生物成分中更加真实的模仿组织环境而进行的早期努力形成了水凝胶，例如，胶原蛋白、纤维蛋白和基质胶。最近，合成的、自组装肽凝胶(PuraMatrix公司)、藻蛋白酸盐海绵状物(AlgiMatrix公司)、和透明质酸-衍生的凝胶剂(Glycosan)成为可以商业购得的物质。但是，这些方法的价格高的惊人，工艺上来讲也并不实用，并且不适合于许多基于细胞的高处理能力试验，这些方法主要从二维系统着眼进行设计，但是通常，当需要在三维空间中进行培养时，这些系统不能支持广泛的弹性要求。进一步讲，在很多情况下，细胞在体外对药物组合物和生物学物质的反应不能够准确的预测相应的体内功能性和毒性。

发明内容

根据本发明的执行过程，可以提供一种或者更多种下列能力。同时，还可以提供一系列具有不同的刚性模量(即，硬度)的孔。在一种实施方案中，可以制造一种具有大面积柔软底物的多孔平板。可以商业购得的或者定做的试验可以用于检测细胞在平板上的反应，所述平板的硬度在50帕斯卡到150,000帕斯卡范围内。例如，可以检测肺部成纤维细胞的增殖作用和凋亡作用，这两个作用主要取决于底物的刚性模量。细胞可以在平板上生长，并且可以按照与常规的多孔平板相同的方式进行操作和分析。

在一种实施方案中，水凝胶可以附着(即，牢固的附着)在小孔的底部(例如，在24孔板、96孔板、384孔板的底部)。这种稳定的附着作用能够长期的培养细胞，并且与许多能够造成水凝胶缩小和分离的实验试剂相容。所述平板可以支持不同细胞类型的附着和生长并且适用于多种标准多孔平板试验。所述水凝胶的机械性能是可以再生的，并且足够稳定从而增加底物的保存期限。所述水凝胶适用于多种细胞类型的生长，也适用于多种附着的配位体的生长，并且可以与凝胶表面相耦合，所述配位体例如，胶原蛋白I、胶原蛋白IV、纤维连接蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白或者RGD肽。

按照一定方向发生变化的多刚性模量凝胶可以被放入或者在多孔玻璃底平板上产生。具有硬度依赖性的生物学物质可以以一种高处理方式进行评价，并且经历标准的多孔平板试验，包括，但不局限于，细胞增殖作用、细胞凋亡作用、信号发生事件和可溶因子和不可溶因子的检测。

可以对多刚性模量平板上生长的细胞进行固定和免疫染色，或者分离所述细胞进行基因表达和蛋白质分析。附着依赖型细胞可以进行可信度较高的研究，所述附着依赖型细胞包括成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、肿瘤细胞、类骨质细胞和神经元细胞。所述平板可以作为一种工具知道成熟细胞或者胚胎干细胞的分化作用。

这里描述的装置和方法可以有效的应用于计划或者重新计划胚胎干细胞和/或成熟干细胞的活性，例如，后者可以从正常组织或者肿瘤衍生组织中获得。在培养室中培养细胞，所述细胞能够忍受底物硬度方面的变化。重新计划的干细胞可以通过他们的行为(例如，运动或者缺失)进行确认、通过细胞液的物理状态进行确认、通过外观进行确认、通过在基因/蛋白表达方面的变化进行确认、或者经过细胞内加工方式或者分泌的细胞因子以及其他参数进行确认。某些方法和成像系统可以被用于监测细胞特性并识别/筛选具有需要表现型的细胞，例如，处于理想的细胞分化状态的细胞，或者“干性(sternness)细胞”，例如，作为应用到一种细胞或者一群细胞上的培养底物硬度变化的反应的细胞表型。所述方法包括非侵入性方法、非扰乱性方法、可自动方法和定量方法，这些方法可以用于细胞的检测，所述细胞例如成熟干细胞或者胚胎干细胞以及所有细胞表型在分化过程各个阶段的分化细胞。在培养期间，在不同的时间点检测并确定细胞或者细胞群所处的培养环境或者机械应力条件下对应的细胞存活期、干性或者塑性，细胞可以是保藏/固定的，或者以实时方式检测。