[发明专利]具有两个滤波系统的ELISPOT方法

说明书

本发明涉及ELISPOT方法，特别是用于感染和/或传染性疾病的体外诊断和/或体外治疗监测，以及涉及相关的试剂盒。

所谓的“酶联免疫斑点测定(Enzyme-linked immunospot assay)”(ELISPOT)特别用于测量血细胞的抗原-特异性活性。测试通常在具有96孔的微量滴定板(microtiter plates)中执行，每个孔在底部上都具有膜，如果所述测试具有阳性结果，则围绕独立的活性细胞的局部显色反应将在膜上形成。通过对点简单计数或使用数字成像处理系统来执行评估，在该情形中除了点的数量，还可以量化点的尺寸和强度。显色反应是基于局部形成的信使的检测，其经由膜-结合的一抗而被结合。然后，通过结合二抗来显现这些局部结合的信使，所述二抗针对相同的信使，这直接或间接地与显色反应结合。

直到现在，只有反应的细胞的数量在细胞活性测试中得以测试，从而能从中得出关于它们活性的结论。然而在这点上，反应的细胞的数量不是如此重要，或者不仅仅反应的细胞的数量是重要的，而是所有个体细胞的反应的所有性能。例如，各个细胞对抗原的反应可能非常不同，这是由如之前所提及的，每个个体细胞所释放的信使量以及由此引发的显色反应量所证明的。EP0957359A2描述了一种ELISPOT方法，其中不仅可以确定反应细胞的数量，还可以确定整个反应的强度。这允许得出基本上更深入的关于细胞活性的结论。

但是，ELISPOT方法的一个基本问题涉及细胞的靶向检测，所述细胞在抗原存在的情况下分泌两种或更多种不同的信使。另一个问题包括与其他仅分泌一种信使的细胞分开地检测这些细胞。

正如在介绍中所提及的，在ELISPOT方法范围内的细胞的测量通常是基于显色反应，所述显色反应取决于对应染料的化学发光或荧光特性。传统上用于化学发光或荧光测量的滤波系统通常是基于单一滤波器组件，关于染料的激发和发光，所述单一滤波器组件只对特定波长范围的光进行传输。确认无疑的是，所谓的双滤波器至今仍被使用。但是，其缺点在于这些滤波器只对于相对宽的光谱范围来说是可传输的。由于染料通常能够在它们的“理想”光谱范围外吸收和发射光，所以使用双滤波器用于测量分泌两种或更多种不同信使的细胞会引起对测量精确性的明显约束。该问题基于下面事实而恶化：所述细胞通常分泌不同量的信使。

因此，本发明的目的就是提供一种ELISPOT方法，所述ELISPOT方法可以避免现有技术中已知的缺点，特别是适于对分泌两种或更多种不同信使的细胞进行灵敏测量。

根据本发明，该目的是由具有独立权利要求1的特征的方法来实现的。该方法的优选实施方式是从属权利要求2至19的客体。本发明的另一方面涉及根据独立权利要求20和21的方法的用途。本发明进一步包括具有独立权利要求22的特征的试剂盒。所有权利要求的措辞在此通过引用结合到该说明书的内容中。

根据本发明的方法是ELISPOT方法(“酶联免疫斑点测定”)，特别是用于感染和/或传染性疾病的体外诊断和/或体外治疗监测，其特征在于真核细胞，优选在测试表面或载体上，与抗原进行孵育，并测量免疫活性细胞的数量，其中作为对抗原的反应，所述免疫活性细胞分泌至少两种不同的细胞因子，以及为了测量免疫活性细胞，借助至少两种不同染料以及至少两种不同的滤波器组件，使得它们得以显现，所述滤波器组件包括窄带滤波器。

本发明提供了一种ELISPOT方法，其允许相对于仅分泌一种细胞因子类型的其他免疫细胞，选择性地检测分泌两种或更多种不同细胞因子的免疫细胞。根据本发明，所述免疫细胞的选择性测量基于具有窄带滤波器的不同的滤波器组件的使用，其用于染料激发和发射光的限制传输从而允许染料发光的选择性检测，优选地染料发出的荧光(窄带滤波器是带通滤波器，其只对窄的光谱范围是可传输的)。特别有利的是，因此有可能避免不同染料发光的干涉，特别是强发光叠加在弱发光上时。与现有技术中已知的ELISPOT方法相比，由此对免疫细胞来说能实现灵敏性的显著地增加，所述免疫细胞在存在抗原的情况下分泌两种或更多种的细胞因子。

在特别地优选实施方式中，窄带滤波器用于每个滤波器组件，所述窄带滤波器分别补偿染料之一的光谱特性。这样，有利的是有可能避免前面提及的发光叠加的问题。

根据本发明，原则上，除了窄带滤波器，滤波器组件还可以包括宽带滤波器。但是针对免疫活性细胞的显现来说，优选使用只包含窄带滤波器的滤波器组件。在另一个实施方式中，用每个滤波器组件中的两个窄带滤波器来执行操作。根据本发明，特别是，每个滤波器组件由两个窄带滤波器组成。