[发明专利]对柠檬酸盐稳定的中性金属蛋白酶的用途和生产

说明书

相关申请

本申请要求2007年10月31日提交的名称为“对柠檬酸盐稳定的中性金属蛋白酶的用途和生产”的美国临时专利申请系列号60/984,046的优先权权益。

发明领域

本发明提供了包含至少一种中性金属蛋白酶的方法和组合物，其中所述的中性金属蛋白酶在金属螯合剂的存在下具有改良的稳定性。在一些实施方案中，该中性金属蛋白酶可用于清洁以及包含柠檬酸盐的其它应用。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了包含变体中性金属蛋白酶的方法和组合物，其中所述的变体中性金属蛋白酶已被改造以对柠檬酸盐诱导的自溶解具有抗性。

发明背景

芽孢杆菌属(Bacillus)的成员是革兰氏阳性细菌，其分泌许多工业上有用的酶，所述酶可通过发酵而大量廉价地产生。分泌的芽孢杆菌酶的实例是枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶、含锌的中性蛋白酶、α-淀粉酶以及纤维素酶。芽孢杆菌蛋白酶广泛应用于纺织品、洗衣店和家用工业中(Galante，Current Organic Chemistry，7：1399-1422，2003；以及Showell，Handbookof Detergents，Part D：Formulation，Hubbard(编辑)，NY：Taylor andFrancis Group，2006)。从被洗的东西中高效移除颜色和染色需要蛋白酶。然而，清洁和洗涤剂的液体制备物通常含有增效助剂、表面活性剂和金属螯合剂，其对大多数蛋白酶具有去稳定效果。

一般而言，变性剂诱导金属蛋白酶通过自溶快速地降解。因此，已经研究了蛋白酶自溶的分子机制作为产生稳定的金属蛋白酶的途径(Eijsink等，J Biotechnol，113：105-120，2004)。对自溶途径的理解是很复杂的，因为(i)蛋白酶局部降解变性蛋白形态的高效率，以及(ii)因为多种未折叠形态很可能存在并遍布于蛋白质分子，导致多种和平行的自溶途径。已报道了嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶自溶的分子机制(Eijsink等，Nat Struct Biol，2：374-379，1995；van den Burg等，Biotechnol Appl Bioeng，30：35-40，1999；以及Vriend，J Comput Aided Mol Des，7：367-396，1993)。

然而，在本领域仍然需要阐明其它工业有关的金属蛋白酶的自溶机制。具体而言，仍然需要了解柠檬酸盐诱导的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)中性金属蛋白酶(NprE)的自溶作用，其可用于设计在钙螯合剂的存在下具有改良的稳定性的NprE变体。这在解淀粉芽胞杆菌NprE的情况下尤为重要，因为该酶的结构和功能依赖于钙，使其更易受到诸如柠檬酸盐的钙清除剂的影响。

发明概述

本发明提供了包含至少一种中性金属蛋白酶的方法和组合物，其中所述的中性金属蛋白酶在金属螯合剂的存在下具有改良的稳定性。在一些实施方案中，该中性金属蛋白酶可用于清洁以及包含柠檬酸盐的其它应用。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了包含变体中性金属蛋白酶的方法和组合物，其中所述的变体中性金属蛋白酶已被改造以对柠檬酸盐诱导的自溶解具有抗性。

本发明提供了分离的中性金属蛋白酶变体，其对柠檬酸盐诱导的自溶作用具有改良的抗性。在一些优选的实施方案中，该中性金属蛋白酶变体是具有以下氨基酸序列的芽孢杆菌中性金属蛋白酶变体，所述序列在选自等价于SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的位置129、130、138、190和220中的3个、4个或5个处包含替换。在一些优选的实施方案中，所述替换包含选自S129I/F130L/D220P、M138L/V190I/D220P和S129I/F130L/M138L/V190I/D220P的多重突变。在优选的实施方案中，该芽孢杆菌是解淀粉芽胞杆菌。在一些实施方案中，该中性金属蛋白酶与包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的中性金属蛋白酶具有至少约45％、至少约50％、至少约53％、至少约55％、至少约57％、至少约60％、至少约63％、至少约65％、至少约67％、至少约70％、至少约73％、至少约75％、至少约77％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的氨基酸同一性。本发明还提供了编码本文所述中性金属蛋白酶变体的分离的核酸，以及包含该核酸的表达载体。此外，本发明还提供了包含该表达载体的宿主细胞。在另一实施方案中，本发明提供了从所述包含该表达载体的宿主细胞中获得的中性金属蛋白酶变体。