[发明专利]西尼罗病毒疫苗及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及使西尼罗病毒的病毒样颗粒能够高分泌表达的人工信号肽、包含编码包括所述信号肽的西尼罗病毒衍生蛋白的核酸的重组表达载体、具有所述载体的转化体、使用所述转化体生产西尼罗病毒的病毒样颗粒的方法、包含由所述方法获得的病毒样颗粒的西尼罗病毒疫苗等等。

背景技术

西尼罗热是一种由西尼罗病毒(WNV)感染所引起的全身急性发热疾病。偶而，所述病毒侵袭中枢神经系统并在其中生长，引起致命性脑膜炎。WNV广泛分布于非洲、中东、部分欧洲、俄罗斯、印度、印度尼西亚等等。所述病毒通过感染环在作为载体的库蚊和作为扩增动物的禽类(野生和驯养)之间得以保持和繁殖。在该过程期间，人、马和家畜成为偶见寄主。

在1999年夏季，WNV侵袭美国纽约并在美国纽约本地化，并且从那以后已经连续扩张。已证实，截至去年(2007)九月，在全美超过2300人受到感染，因此引起严重的公众健康问题。目前世界上不存在人WNV疫苗。

在这种情况下，开始担心病毒传播至包括日本在内的亚洲国家，并且已经需要研制人疫苗。尽管培养Vero细胞来源的病毒钝化疫苗目前正在紧急地开发，但对于可以在生产步骤中不采用生物安全水平3病毒的情况下以低成本安全生产的亚单位疫苗的开发存在渐增的需求。

WNV首先在1937年在非洲乌干达的西尼罗河区域得到分离，并分类为黄病毒科黄病毒属(非专利文献1)。病毒颗粒的结构由其中衣壳蛋白(C蛋白)被结合至一个(+)链RNA病毒基因的球形结构和围绕该球形结构的脂双分子层膜组成。该脂膜包括两类蛋白质：包膜蛋白(E蛋白)和膜蛋白(M蛋白)。M蛋白作为前体prM蛋白产生并用称为弗林蛋白酶(furin)的蛋白酶切割成为成熟蛋白质。

本发明人以前报道了JEV VLP的生产方法，其包括将包含编码日本脑炎病毒(JEV)的prM蛋白和E蛋白的cDNA片段的表达载体引入动物细胞中，培养所获得的转化细胞并收获分泌在培养基中的病毒样颗粒(VLP)(专利文献1)。然而，还未曾有报道涉及WNV亚单位疫苗的生产。

专利文献1：JP-A-2004-65118

非专利文献1：Agrawal，A.G.，L R.Petersen，J.Infect.Dis.，188：1-4(2003)

发明内容

本发明解决的问题

本发明的一个目的是提供可用作安全经济的WNV疫苗成分的WNV VLP的高分泌生产方法，从而能够开发和稳定供应WNV疫苗。本发明的另一个目的是提供能够在动物体中产生上述VLP的WNVDNA疫苗。

解决问题的手段

发明人已经进行了广泛的研究，努力实现上述目的，并成功地通过将包含编码WNV的prM蛋白和E蛋白的DNA片段的表达载体引入动物细胞中和在培养基中培养获得的转化细胞而在培养基中有效地分泌VLP。而且，本发明人已经发现，出乎意料地，通过改变位于prM蛋白上游的信号肽，VLP的形成或分泌效率与WNV的天然全长信号序列相比可以被显著地改善。

本发明已经基于这些发现进行进一步的研究并完全本发明。

因此，本发明提供

[1]信号肽，其包含与下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列

(a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列

(b)上述(a)的氨基酸序列的部分氨基酸序列，其包含至少氨基酸NO：11-25所示的氨基酸序列；

[2]分离的核酸，其基本上由编码上述[1]的信号肽的碱基序列组成；

[3]西尼罗病毒样颗粒表达载体，其包含核酸，所述核酸包含编码上述[1]的信号肽和来源于西尼罗病毒的prM蛋白和E蛋白的碱基序列；

[4]通过用上述[3]的载体转化获得的转化体；

[5]产生西尼罗病毒样颗粒的方法，其包括培养上述[4]的转化体和回收分泌在培养基中的病毒样颗粒；

[6]通过上述[5]的方法获得的西尼罗病毒样颗粒；

[7]西尼罗病毒疫苗，其包含上述[6]的颗粒作为活性成分；

[8]西尼罗病毒疫苗，其包含上述[3]的载体作为活性成分；等等。

发明效果

通过将本发明的信号肽连接到由WNV的prM蛋白和E蛋白组成的多蛋白，在宿主细胞中VLP的形成和胞外分泌效率可以被改善。因此，包含信号肽和编码prM蛋白和E蛋白的核酸的分泌型表达载体可用于高度分泌或产生WNV VLP的细胞系的制备，而且，该载体本身可用作WNV DNA疫苗。

附图概述

图1显示由重组表达载体(pWPME1-pWPME14)编码的多肽。