[发明专利]生物活性核酸酶的快速体内鉴定

权利要求书

1.一种用于通过一种或多种核酸酶检测靶序列的双链裂解的报告构建体，所述报告构建体包含由所述核酸酶所识别的靶序列分隔开的报告基因的重叠和非功能序列。

2.根据权利要求1所述的报道构建体，其中所述报道基因可操作地连接至启动子序列。

3.根据权利要求2所述的报道构建体，其中所述启动子是组成型的。

4.根据权利要求2所述的报道构建体，其中所述启动子是诱导型启动子。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的报道构建体，其中所述报道基因编码酶。

6.根据权利要求5所述的报道构建体，所述报道构建体还包含编码可选择的标记物的序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的报道构建体，所述报道构建体还包含在离散型报道基因序列旁侧的同源区。

8.一种包含根据权利要求1至7中任一项所述的报告构建体的宿主细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述细胞为真核细胞。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中所述细胞为酵母细胞。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的宿主细胞，其中所述报道构建体在所述宿主细胞中瞬时表达。

12.根据权利要求8至10中任一项所述的宿主细胞，其中所述报道构建体被稳定整合到所述宿主细胞中。

13.一种鉴定在特异靶位点诱导裂解的核酸酶的方法，所述方法包括下列步骤：

将表达所述核酸酶的一个或多个表达构建体引入根据权利要求8至12中任一项所述的宿主细胞，其中所述报道构建体包含所述核酸酶所识别的靶序列。

在使所述核酸酶被表达的条件下孵育所述细胞；以及

测量所述细胞中报道基因表达的水平，其中报道基因表达的水平的增加与核酸酶诱导的所述靶序列的裂解的增加相关。

14.一种将一组核酸酶在特异靶位点诱导裂解的活性评级的方法，所述方法包括下列步骤：

将编码所述组核酸酶的一个或多个表达构建体引入不同的根据权利要求8-12所述的宿主细胞中，其中所述宿主细胞中的所述报道构建体包含所述核酸酶所识别的靶序列；

在使所述核酸酶被表达的条件下孵育所述细胞；

测量所述细胞中报道基因表达的水平；以及

根据所述宿主细胞中诱导的报道基因活性的水平将所述核酸酶评级。

15.一种预测核酸酶体内裂解活性的方法，所述方法包括下列步骤：

将编码所述核酸酶的表达载体引入根据权利要求8至12中任一项所述的宿主细胞中，其中所述报道构建体包含所述核酸酶所识别的靶序列。

在使所述核酸酶被表达的条件下孵育所述细胞；以及

测量所述细胞中报道基因表达的水平；

其中较高水平或报道基因表达预示体内有活性的核酸酶。

16.一种测定由核酸酶所引起的对宿主细胞毒性作用的方法，所述方法包括下列步骤：

将编码所述核酸酶的表达构建体引入宿主细胞中；

在使所述核酸酶被表达的条件下孵育所述细胞；

培养所述细胞一段时间；以及

在不同时间间隔测量培养物中细胞的生长，其中生长的减弱与所述核酸酶的毒性作用的增加相关。

17.一种选择生物活性的核酸酶的方法，所述方法包括下列步骤：

根据权利要求13所述鉴定在所选择的靶位点裂解的核酸酶；以及

将编码所述核酸酶的表达构建体引入宿主细胞中；

在使所述核酸酶被表达的条件下孵育所述细胞；

培养所述细胞一段时间；以及

在不同时间间隔测量培养物中细胞的生长，其中选择表现出裂解活性和低毒性的生物活性核酸酶。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述细胞的生长通过分光光度法测定。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含根据权利要求1至7中任一项所述的报告构建体。

20.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，所述核酸酶包括归巢核酸内切酶。

21.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述核酸酶包括工程化锌指核酸酶或工程化锌指核酸酶对。