[发明专利]在重组酵母中生产二羧酸

说明书

本发明涉及包含下述核苷酸序列的重组酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化为延胡索酸的酶，本发明还涉及用于生产二羧酸的方法。

二羧酸例如延胡索酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转化为1，4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ-丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和BDO制造的聚酯聚合物。

琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为对环境有害，并且昂贵。琥珀酸的发酵生产可以是生产琥珀酸的一种有吸引力的替代性方法，其中可以使用可再生的原料作为碳源。

已知大量不同的细菌如Escherichia coli和瘤胃细菌Actinobacillus、Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia或Succinimonas sp.能生产琥珀酸。对这些细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产率和/或生产力，或者减少了副产物形成。

WO2007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母，用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白(MAE)对所述酵母加以转化。

尽管琥珀酸的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产琥珀酸的改进的微生物。

本发明的一个目的是用于生产二羧酸如延胡索酸和琥珀酸的替代性酵母。

根据本发明用编码下述核苷酸序列的重组酵母实现了这一目的，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化成延胡索酸的异源酶。惊讶地发现，通过根据本发明的重组酵母，生产出的二羧酸如延胡索酸和/或苹果酸的量与野生型酵母相比有所提高。

在本文中使用时，根据本发明的重组酵母被定义为下述细胞，所述细胞含有天然不存在于所述酵母中的核苷酸序列和/或蛋白质，或所述细胞经天然不存在于所述酵母中的核苷酸序列和/或蛋白质转化或遗传修饰，或者其含有内源核酸序列(或蛋白质)的额外一个或多个拷贝。野生型酵母在本文中被定义为重组酵母的亲本酵母。

优选地，编码酶的核苷酸序列表达后，催化苹果酸转化成延胡索酸的酶在胞质溶胶中有活性。

催化苹果酸转化成延胡索酸的酶优选地具有延胡索酸酶活性，优选地所述酶为EC 4.2.1.2的延胡索酸酶。

催化苹果酸转化成延胡索酸的酶可以来自于任何合适的起源，例如细菌、酵母、真菌、原生动物或植物。优选地，根据本发明的酶来自于Rhizopus oryzae。

显示：Rhizopus oryzae的异源fumR基因在Aspergillus niger中的表达在氧受限的条件下不导致琥珀酸生产(PhD thesis，2006 W.A.de Jongh，Biocentrum Technical University of Denmark)。令人惊讶的是，表达本发明的异源延胡索酸酶的酵母在氧受限的条件下生产与野生型酵母相比更大量的琥珀酸。

用于表示给定(重组)核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系时，术语“同源的”被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子即由相同物种的宿主细胞或生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。

关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”是指下述核酸或蛋白质，所述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在，或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组生产的。

优选地，根据本发明的酵母是包含下述核苷酸序列的酵母，所述核苷酸序列编码催化苹果酸转化成延胡索酸的酶，其中所述酶与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列、优选与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％、75％，优选至少80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，优选所述酶包含SEQ ID NO：3。

序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两条或更多条核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在被比较的序列的整个长度上比较序列。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。