[发明专利]制备RPE细胞和RPE细胞的组合物的改良方法

权利要求书

1.一种制备视网膜色素上皮(RPE)细胞的基本上纯化的培养物的方法，所述方法包括：

a)提供人胚胎干细胞；

b)在营养物丰富的低蛋白培养基中将所述人胚胎干细胞培养为胚状体；

c)在营养物丰富的低蛋白培养基中将所述胚状体培养为贴壁培养物；

d)在营养物丰富的低蛋白培养基中培养(c)的细胞贴壁培养物，所述培养基不含无血清B-27补充物；

e)在能够支持高密度体细胞培养物生长的培养基中培养(d)的细胞，由此细胞培养物中出现了RPE细胞；

f)使(e)的培养物与酶接触；

g)从培养物中选择RPE细胞并将所述RPE细胞转移到含有补充有生长因子的培养基的单独培养物中以制备RPE细胞的富集培养物；以及

h)使所述RPE细胞的富集培养物繁殖以制备RPE细胞的基本上纯化的培养物。

2.如权利要求1所述的方法，其中进一步培养所述RPE细胞以制备成熟RPE细胞的培养物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中(b)和/或(c)的培养基含有无血清B-27补充物；

4.如权利要求2所述的方法，其中所述细胞在选自下列的培养基中培养：VP-SFM、EGM-2和MDBK-MM。

5.如权利要求2所述的方法，其中(g)的生长因子选自：EGF、bFGF、VEGF和重组胰岛素样生长因子。

6.如权利要求2所述的方法，其中所述培养基含有下列物质的一种或多种：肝素、氢化可的松或抗坏血酸。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中将(b)的细胞培养7-14天。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将(c)的细胞培养7天。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中将(d)的细胞培养7-10天。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中将(e)的细胞培养14-21天。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中(b)的培养基选自MDBK-GM、OptiPro SFM和VP SFM。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中(c)的培养基选自MDBK-GM、OptiPro SFM和VP SFM。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中(d)的培养基选自MDBK-GM、OptiPro SFM和VP SFM。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中(e)的培养基选自MDBK-MM、Optipro SFM和VP SFM。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中(g)的培养基选自EGM-2和MDBK-MM。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中(g)的生长因子选自：EGF、bFGF、VEGF和重组胰岛素样生长因子。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中(g)的培养基含有下列物质的一种或多种：肝素、氢化可的松或抗坏血酸。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中(f)的酶选自：胰蛋白酶、胶原酶和分散酶。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述人胚胎干细胞具有降低的HLA抗原复杂性。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述方法根据药品生产质量管理规范(GMP)实施。