[发明专利]RNA的亚硫酸氢盐处理

说明书

技术领域

本发明涉及使用亚硫酸氢盐处理RNA的方法。

背景技术

现已证实在单链DNA中，与以非常慢的速度将5-甲基胞嘧啶脱氨基成为胸腺嘧啶相比，亚硫酸氢钠优先将胞嘧啶脱氨基成为尿嘧啶(Shapiro，R.，DiFate，V.，and Welcher，M，(1974)J.Am.Chem.Soc.96：906-912)。这项观察结果成为Frommer等人1992年的开发亚硫酸氢盐基因组测序方案的基础(Frommer M，McDonald LE，Millar DS，Collis CM，Watt F，Grigg GW，MolloyPL and Paul CL.PNAS 89：1827-1831(1992)，该文献通过引用并入本文)。概括而言，现在使用的Frommer方法包括以下基本步骤：DNA的碱变性；使用亚硫酸氢钠进行脱氨基；通过脱盐进行脱磺化，随后进行碱处理并中和。尽管所述条件适合于进行DNA的亚硫酸氢盐处理，但是该所使用的严厉条件将彻底破坏RNA。因此，由于降解，在这些条件下使用亚硫酸氢钠处理RNA的任何测定法在临床环境下都是无效的。

亚硫酸氢盐修饰方法以及其已建立的变式方法的缺点之一是现已发现该方法即便使用DNA作为起始材料，也导致84-96％的原始输入DNA发生降解(Grunau et al.Nucleic Acids Research 29(13)e65(2001))。与此方法相关的巨大损失意味着实践上很难成功地分析少量细胞的甲基化状态，或成功地分析DNA已经处于部分降解状态的古老的保存标本(archival specimen)。此外，由于与现有方法相关的固有的降解，不可能按照已经被公立的人类基因组计划(International Human Genome Sequencing Consortium，2001，Nature，409，860-921)或私人的CELERA测序计划(J Craig Venter et al.，2001，Science，291，1304-1351)所成功使用的相同方式对生物体的完整基因组进行测序和装配以确定整个基因组范围内的甲基化状态，这是因为DNA被片段化使得由于在序列中存在大量“间隙(gap)”而使其不能以任何有意义的方式被克隆、测序和组装。由上述说明可见，此类条件将使RNA完全降解，因此阻碍了任何用于检测的下游程序。

现有技术中使用的亚硫酸氢盐方法的另一个缺点是通常只有小片段的DNA可以被扩增。经验表明，通常可成功处理并扩增不到约500个碱基对(bp)。该现有技术不适用于新的分子生物学方法，例如长距离聚合酶链反应(PCR)，其使得扩增一般长达约50kb的大段未处理基因组DNA成为可能。目前，甚至还不可能分析完整基因的甲基化状态，因为在哺乳动物基因组中大量基因的长度超过50kb。上述事实又进一步使经亚硫酸氢盐处理的RNA的扩增复杂化。

即便是为了观察相对小的基因(＜4kb)的甲基化状态，PCR反应也不得不艰难地通过目的基因区域(D.S Millar，K.K Ow，C.L.Paul，P.J.Russell，P.L.Molloy，S.J.Clarke，1999，Oncogene，18(6)：1313-24；Millar DS，Paul CL，MolloyPL，Clarke SJ.(2000).J Biol Chem；275(32)：24893-9)。目前用于亚硫酸盐DNA处理的方法还是繁琐和耗时的。标准方法通常需要多次试管转换、柱纯化、透析、将DNA包埋在琼脂糖珠中或在反应中加入添加剂以试图减少例如基因组DNA的某些区域未转化这样的问题。