[发明专利]核酸扩增

说明书

发明领域

本发明涉及选择性扩增特定核酸序列的方法。扩增的选择性通过将至少一种经修饰的寡核苷酸引物与其相应的协助寡核苷酸(facilitatornucleotide)一同使用于热循环(thermocyclic)酶扩增反应来达成。选择性亦通过所述协助寡核苷酸所结合的位于扩增子内的序列来提供。本发明亦涉及对扩增产物的操作，以及根据本发明方法产生的修饰产物的用途，例如，添加3’单链序列，其可用作独特的核苷酸序列结合位点。

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)为迅速合成核酸分子给定区段大量拷贝的方法(参见，例如，Mullis et al US Patent Nos.4683195，4683202 and 4800159)。PCR技术极端敏感，理论上仅需要一个单独的核酸分子以供扩增。PCR为酶介导的反应，通常将模板分子，一对寡核苷酸引物与核酸聚合酶掺入反应介质中，所述介质包含合适的盐，金属阳离子，游离核苷酸与pH缓冲系统。PCR过程为基于双链核酸变性，继以寡核苷酸引物退火结合于所述核酸模板，并通过聚合酶进行引物延伸的反复循环。所述PCR中所用的寡核苷酸引物设计为退火结合于所述模板分子的相反链，并定位于侧接(flanking)需扩增的靶序列的。当引物从其3’末端通过所述聚合酶延伸时，延伸产物提供原先靶序列的拷贝，其可顺次作为后继扩增轮次的模板分子而起作用。PCR扩增导致个别核酸分子的指数性增加，以获取所需量的扩增核酸产物，其长度由所述寡核苷酸引物的5’末端所限定。

虽然大体而言，PCR简单且具有特异性，但其易受几种类型的不希望的矫作物的影响，其对于用户而言可为成问题的，且可妨碍所述技术的选择性与特异性。举例而言，片段非特异性扩增可来自所述引物的一个或两者结合于靶序列以外的序列，其可产生一个或多个非所期望产物的片段。引物的非特异性结合频繁出现，且可为下述原因导致，例如，在靶核苷酸序列模板上引物结合序列交替存在，在外源污染分子上相似引物结合序列的存在和/或欠佳的引物序列设计。这些非特异性核酸产物可为成问题的，尤其是当含有所述靶序列的模板核酸以少量拷贝存在时。

在一些情况下，引物可能结合于仅为部分互补的结合位点，甚至当与其结合的DNA的错配存在于引物3’末端时亦被延伸(例如，参见Kwok et al.1990，″Effects of primer template mismatches on the polymerase chain-reaction-human-immunodeficiency-virus type-1 model studies.″Nucleic Acids Research18(4)：999-1005)。由于该原因，可发生不希望的非特异性扩增。当拷贝由引导错误(mispriming)产生的DNA链时，产生了完全匹配所述引物的引物结合位点。从而在标准PCR中可出现不希望的产物，且其两个末端均具有完全互补于引物的结合位点。从而一旦该不希望的产物产生，其很可能将以高效率扩增。换言之，一旦出现引导错误，在标准PCR中不再可能具有后继的特异性。尽管数种类型的探针可用于特异性的检测希望的靶，但若发生了过多非特异性扩增，所期望产物的产生可遭阻遏，或减少到使用所述特异性探针无法检测的水平。该情况最可能在当所述目标仅仅构成总核酸的非常微小部分时发生。

当非特异性扩增发生在PCR循环早期轮次时，亦导致其加剧。通常在现有PCR技术中，由所述引物序列产生的特异性仅仅在所述PCR早期轮次中达成。一旦产生了相当量的产物，无论引物是侧接靶序列的预期位点还是从由引导错误产生的非特异性扩增子延伸，扩增均以相同速率继续。换言之，即使当引物可能结合且延伸自引物仅具有部分互补性的错误位点发生，所扩增的非特异性产物由于所述PCR技术掺入了准确的引物结合序列，且其在后续PCR循环中与含有所述靶序列的核酸模板以相同效率竞争寡核苷酸引物的结合。在例如等位基因特异性PCR之类的应用中，通常需要在引物设计中着重注意以及在技术优化中相当努力以尽可能减少引导错误。