[发明专利]核酸扩增相关污染物的清除

权利要求书

1.非天然碱基和能够降解含非天然碱基的核酸的酶在扩增反应中清除所述扩增反应中残留污染物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述非天然碱基是肌苷、黄嘌呤核苷、oxanosine、脱氧核苷酸或其脱氧-三磷酸类似物。

3.如权利要求2所述的应用，其中所述非天然碱基是脱氧肌苷三磷酸(dITP)、脱氧黄嘌呤核苷三磷酸(dXTP)或deoxyoxanosine(dOTP)。

4.如权利要求2所述的应用，其中所述非天然碱基是肌苷或脱氧肌苷三磷酸(dITP)。

5.如权利要求1至4中任一项所述的应用，其中所述酶是内切核酸酶。

6.如权利要求5所述的应用，其中所述内切核酸酶是源自嗜温或耐热细菌的内切核酸酶V。

7.如权利要求1至6中任一项所述的应用，其中所述扩增反应是普通核酸或亚硫酸氢盐处理的核酸的线性或指数性复制。

8.如权利要求7所述的应用，其中所述核酸是DNA或RNA。

9.一种扩增反应混合物，其包含：

(a)脱氧肌苷三磷酸(dITP)、脱氧黄嘌呤核苷三磷酸(dXTP)或deoxyoxanosine(dOTP)或其组合；

(b)脱氧核苷酸(dNTP)，其包含脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)；

(c)能够降解含肌苷、黄嘌呤核苷或oxanosine的核酸的酶；和

(d)耐热聚合酶。

10.如权利要求9所述的扩增反应混合物，其包含脱氧肌苷三磷酸(dITP)。

11.如权利要求9或10所述的反应混合物，其含有与dITP、dXTP或dOTP浓度相比限制浓度的一种或多种dNTP。

12.如权利要求9至11中任一项所述的反应混合物，其中所述能够降解含非天然碱基的核酸的酶是内切核酸酶。

13.如权利要求12所述的反应混合物，其中所述酶是内切核酸酶V。

14.如权利要求9至13中任一项所述的反应混合物，其中所述耐热聚合酶选自由嗜热和嗜温DNA聚合酶、逆转录酶、内切核酸酶、其突变体和嵌合体组成的组。

15.如权利要求14所述的反应混合物，其中所述耐热聚合酶选自Taq、Pfu、Tth、5D4和来自超好热始原菌(Thermococcus kodakaraensis)KOD1的KOD。

16.如权利要求9至15中任一项所述的反应混合物，其进一步包含用于扩增的引物或引物组。

17.一种用于清除可在核酸扩增反应期间出现的残留污染物的方法，所述方法包括：

提供含待被扩增的核酸模板的样品；

提供用于扩增反应的引物、探针或寡核苷酸；

提供权利要求9至15中任一项所述的扩增混合物；

进行温育反应，使得所述反应混合物中含肌苷、黄嘌呤核苷或oxanosine的任何扩增子被能够降解含肌苷、黄嘌呤核苷或oxanosine的核酸的酶降解；

将温育的反应混合物在一定温度下加热，以灭活所述能够降解含肌苷、黄嘌呤核苷或oxanosine的核酸的酶；和

进行扩增反应以从所述核酸模板中扩增所期望的产物。

18.如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括：

处理或分析所述扩增产物。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述处理或分析包括测定所述扩增产物的序列、甲基化状态、大小、长度。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述处理或分析包括对所述扩增产物进行凝胶电泳、杂交、消化、实时扩增、基于阵列的方法、RFLP分析。

21.如权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述样品包括天然的和亚硫酸氢盐修饰的DNA、RNA和cDNA或其组合。

22.如权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述温育反应在0℃至70℃下进行1秒至90分钟。