[发明专利]制备减毒病毒株的方法

说明书

本发明涉及制备减毒病毒株的方法，其包括通过用浓度递增的至少一种硫酸化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒一起连续传代而实现所述聚合物与所述病毒的接触，其中所述易感病毒的特征在于减少病毒板的方法，其中由所述减毒病毒得到的病毒株具有不同于产生其的野生型病毒株株的稳定的表型和基因型特征。所述方法包括通过用浓度递增的所述硫酸化聚合物连续传代约15次或更多次而实现所述硫酸化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒的接触。根据本发明方法，第一次传代中所述至少一种硫酸化聚合物的浓度应小于所述聚合物针对野生状态下易感病毒的IC₅₀。

特别地，本发明涉及下述方法，包括通过用浓度递增的连续传代使至少一种硫酸化聚合物与对所述聚合物的抑制敏感的病毒相接触以改变所述病毒的致病性行为。

在本发明的一个特定目的中，还涉及通过上述方法获得的减毒病毒株，以及包含所述减毒病毒株的治疗性或预防性组合物。此外，本发明还包括含有通过本发明方法得到的减毒病毒株的疫苗。

背景技术

硫酸化多糖是非常丰富且易得的化合物，其可分离自多种天然来源，并且因其广泛而多样的物理化学性质而为人所知，这使得它们适于医学和药理学领域中的不同应用。由于其免疫调节剂和抗肿瘤剂活性，对凝血系统和炎性过程的作用，它们已显示出通过影响病毒复制而可用于皮肤病学、饮食计划等方面。可发现的其天然来源有藻类，它们构成了细胞壁。根据藻类的类型，可分离具有与糖胺聚糖(GAG)类似结构的那些，其可具有广泛的抗病毒活性(Pujol C.A等，2007)。因此，其抑制广谱包膜病毒的有效作用可以针对例如逆转录病毒：1型和2型人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)，疱疹病毒：1型和2型疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)，人巨细胞病毒(HCMV)，假狂犬病毒；黄病毒：2型登革病毒；天花病毒；天花病毒(variola virus)；肝DNA病毒：乙型肝炎病毒(HBV)；正粘病毒：甲型流感病毒(infA)；副粘病毒：呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒；棒状病毒：水泡性口膜炎病毒(VSV)；嵌沙样病毒：胡宁病毒(Juninvirus)，塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)；披膜病毒：辛德毕斯病毒，塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(表1)和一些无包被病毒，例如脑心肌炎病毒、甲型肝炎病毒(Girond S等1991)和乳头状瘤病毒(HPV)(Buck CB等，2006)，包括DNA与RNA病毒。对于这些病毒中的大部分而言，病毒与细胞的初始结合主要由毒粒与已知为硫酸乙酰肝素的GAG类型的细胞表面的相互作用所介导(Esko JD，Selleck SB，2002)。

通常，已知硫酸多糖通过化学上模拟硫酸乙酰肝素(heparan sulphate)阻断病毒感染，因此同病毒与细胞表面的初始结合进行竞争。

表1：提取自海藻的硫酸多糖的抗病毒活性

GAG是无分支的长链多糖，其由连续重复的二糖单位(其可以是硫酸化的)形成。GAG可分为两类：糖胺聚糖(例如硫酸乙酰肝素)以及半乳糖胺聚糖(例如硫酸软骨素)。从其名称可看出，定义的差异在于初始引入的糖单位分别为N-乙酰基-葡萄糖胺或N-乙酰基-半乳糖胺。另一个重要区别在于糖胺聚糖以一系列1，4-糖苷键相连，而半乳糖胺聚糖则以交替的1，3-和1，4-糖苷键相连。GAG主要位于细胞表面和中胚层组织的大部分细胞基质中，如表2中所示(结缔组织、软骨、肌肉和骨)，它们经常与蛋白质核心相连，由此形成所谓的蛋白聚糖。GAG是带负电的分子，其可以具有生理意义，例如，透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素。

表2