[发明专利]半衰期延长的人因子Ⅸ变体

说明书

优先权声明

根据35U.S.C.§119(e)，本专利申请要求2007年10月15日提交的美国临时专利申请No.60/999035的权益，该申请的全部内容以其全部形式作为参考并入本文。

背景技术

发明领域

本发明涉及包含附加的糖基化位点的因子IX变体，以及编码该因子IX变体的核酸构建体。

相关技术的说明

可商购的因子IX有血浆来源的产品(Mononine)和重组蛋白(Benefix)。Mononine的缺点在于传播通过由纯化步骤所带有的细菌和病毒(例如HIV，肝炎病毒)污染而造成的疾病的可能。重组蛋白(例如Benefix)的使用避免了这些问题。然而，在实验动物模型系统和人的静脉内(i.v.)弹丸注入后，重组因子IX(r因子IX，例如Benefix)的药物动力学性质比人血浆来源的因子IX(pd因子IX，例如Mononine)的性质差。由于r因子IX不够良好的药物动力学性质，因此一般r因子IX的剂量需要高20-30％以达到与pd因子IX相同的促凝血活性水平(White等，(April1998)，Seminars in Hematology，vol.35，no.2 SuppI.2：33-38；Roth等，(December 15，2001)Blood vol.98(13)：3600-3606)。

已证实向蛋白中添加糖基化位点是延长它们半衰期的重要工具。例如，达贝泊汀-α(Darbepoetin-a)是红细胞生成素的重组形式，其中添加了两个附加的N-连接糖基化位点(Elliott等，Enhancement of therapeutic protein invivo activities through glycoengineering，Nat Biotechnol.(2003)21：414-421)。为了产生达贝泊汀，将残基30和32突变产生一个糖基化位点，并且将残基87、88和90突变产生第二糖基化位点。具有这两个附加糖基化位点的达贝泊汀的半衰期是正常红细胞生成素的三倍；此外，它的安全性与红细胞生成素没有差别。尽管达贝泊汀分子具有5个氨基酸的变化，但是自2004年以来，未鉴别出对达贝泊汀的抗体发展的病例(Smalling等，“Drug-induced andantibody-mediated pure red cell aplasia：a review of literature and currentknowledge”，Biotechnol Annu Rev.(2004)10：237-250；Sinclair等，“Glycoengineering：the effect of glycosylation on the properties of therapeuticprotein”，J Pharm Sci.(2005)94：1626-1635)。添加neo-糖基化位点也延长了瘦素(leptin)和MpI配体的半衰期。

本发明涉及生产具有附加的糖基化位点的因子IX(FIX)变体。该重组因子IX变体的回收值更高和/或半衰期更长从而使得可以向对象施用较低剂量和/或较低频次的因子IX。

发明简述

本发明提供了与野生型因子IX相比，包含一个或多于一个附加的糖基化位点的分离的因子IX(FIX)变体。可以通过以下方式的任意组合来引入所述一个或多个附加的糖基化位点：附加的氨基酸的插入、氨基酸的缺失、氨基酸的取代和/或氨基酸的重排。也可以通过定点突变和/或FIX变体的化学合成引入所述一个或多个附加的糖基化位点。

在一些实施方式中，该附加的糖基化位点中的至少一个位于激活肽(activation peptide)之内。该FIX变体可以包含插入至SEQ ID NO：33所示的人FIX氨基酸序列的N157和N167位置之间的肽片段，并且所述肽片段可以包含约3至约100个氨基酸残基。所述肽片段可以包含小鼠因子IX激活肽的至少一部分(例如，图1，第4行)并且可以修饰所述小鼠激活肽以增加糖基化位点数目(例如图1，第2和3行)。本发明所述的FIX蛋白变体可以是人FIX蛋白。

本发明所述变体FIX的一个或多个附加的糖基化位点可以是N-连接糖基化位点、O-连接糖基化位点以及N-连接糖基化位点和O-连接糖基化位点的组合。