[发明专利]条件性毒性的工程化酶原

说明书

发明领域

本发明总体上涉及生物学、生物化学、和蛋白质工程这些领域。特别是，本发明涉及显示条件性毒性(conditional toxicity)的毒性蛋白的酶原，这些酶原在非靶宿主生物或细胞中是良性的，而在靶生物或细胞中是有毒性的。本发明进一步涉及对这些显示条件性毒性的毒素进行设计、制造、和使用的方法。

背景

细菌性ADP-核糖基化毒素是由病原性细菌产生的蛋白，它们通常被分泌到细胞外的培养基并且通过改变真核细胞的代谢作用而导致疾病(Rappuoli and Pizza，1991)。ADP-核糖基化毒素在将该ADP-核糖部分选择性地连接至它们的靶蛋白之前使NAD分解成其组成部分(烟酰胺和ADP-核糖)。在这些毒素的大多数中，这些靶是细胞功能的关键调节剂，并且由ADP-核糖基化所引起的对它们的活性干扰导致了关键细胞加工的严重失调并且在大多数情况下最终导致细胞死亡。

杀虫性二元毒素的新家族(被命名为Vip1和Vip2)在营养生长阶段已经从芽胞杆菌属中分离出，其中Vip1可能靶向昆虫肠细胞，和Vip2充当将肌动蛋白核糖基化的ADP-核糖基转移酶。这种Vip1-Vip2二元毒素在20-40ng/g饵料(diet)下是对抗玉米根虫(corn root worm)(玉米的重要害虫)的有效杀虫剂。

Vip1-Vip2复合物代表着一类不同于经典的A-B毒素(例如，霍乱毒素)的二元毒素，这些经典的A-B毒素必须组装到复合物(由两个功能不同的亚基或结构域组成)中用于发挥活性。在Vip1-Vip2类的二元毒素中每种多肽很明显地是分开发挥功能的，其中结合膜的100kDa的Vip1多聚体可推定结合着细胞表面受体并且有利于中这种52kDa的Vip2 ADP-核糖基转移酶的递送以进入靶玉米根虫细胞的细胞质。Vip1和Vip2两者均是对抗玉米根虫的最大活性所要求的。NAD-依赖的ADP-核糖基转移酶Vip2可能在Arg177上修饰单体的肌动蛋白以阻断聚合，导致肌动蛋白细胞骨架的损失和最终细胞死亡，这是由于在体内在肌动蛋白微丝之内快速的亚基交换的缘故。1999年，Vip2的三维结构得以解决(Han et al.，1999，Nature Structural Biology6：932-936)。Han等确定：Vip2蛋白是混合的α/β蛋白并且被分成两个结构域，称为N-结构域(残基60-265)和C-结构域(残基266-461)，它们可能代表这些二元ADP-核糖基化毒素的全部类别。Han等鉴定了几种在Vip2-样毒素的生物活性方面重要的结构特征，包括在E428上的催化残基，在Y307、R349、E355、F397、和R400上的NAD结合残基，使这种NAD结合袋稳定的“STS基序”(残基386-388)、和由残基E426和E428形成的NAD结合袋。

因为Vip2与其他二元毒素(例如，肉毒梭菌C2毒素(Clostridium botulinumm C2 toxin)(Aktories等，1986)、产气荚膜梭菌极微小毒素(Clostridium perfringens iota toxin)(Vandekerckhove等，1987)、螺状梭菌(Clostridium spiroforme)毒素(Popoff和Boquet，1987)和由艰难梭菌所产生的ADP-核糖基转移酶(Popoff等，1988))的酶组分共有显著的序列相似性，Vip2代表肌动蛋白-ADP-核糖基化毒素家族。

尽管这种Vip1-Vip2二元毒素具有商业潜在性而成为特异且有效的玉米根虫控制剂用于转基因作物(例如，玉米)，在植物中Vip1-Vip2复合物的表达一直被以下事实制约：Vip2在植物细胞中表达导致严重的发育病理学和对该植物其本身的表型的改变。因此，存在着总体需求来提供设计并制造显示出条件性毒性活性的毒性蛋白，其中该毒素在非靶宿主生物或细胞中作为酶原可以成为良性的，而在靶生物或细胞中是有毒的。更确切地说，存在着需求以便保护表达ADP-核糖基化毒素(例如，Vip2)的非靶生物或细胞免于该毒素的副作用、并且在受到靶向的活系统(例如，昆虫害虫)之内仍保持该毒性活性。当这种非靶生物在实验室中不容易进行试验时(例如，植物)，存在着进一步的需求来研究替代品遗传系统以便更加有效地对酶原进行设计和测试。