[发明专利]通过融合到pⅨ或pⅦ来设计和生成人从头pⅨ噬菌体展示文库,载体、抗体及方法

说明书

技术领域

本发明涉及生成和使用pIX或pVII噬菌体展示文库来产生抗体或抗体片段的组合物和方法。

背景技术

在噬菌体或噬菌粒系统中使用pIII和pVIII作为融合伴侣的丝状噬菌体展示已用作蛋白质工程、尤其是从头(de novo)抗体分离和亲和力成熟的一种技术。人样fab序列可以以已知的抗体序列为模板生成，而随机或诱变的互补决定区(CDR)或抗原结合区(例如重链CDR3(H3))可通过对所关注的抗原或其他蛋白质靶标进行淘选而无须进行免疫来从展示抗体片断序列的变型的噬菌体文库生成和分离。此前使用的人从头抗体文库通过合成法产生或通过未试验过的来源的lgG基因的分子克隆来产生。在合成的文库中，包含可变重链和轻链构架以及CDR区的抗体DNA序列基于以下进行设计和合成：1)确定的lgG基因，2)特定的lg种系基因，3)来自lg种系基因家族的共有序列以及4)来自天然来源的经PCR衍生的lgG片段。除了合成的抗体文库以外，也可通过源自人组织(例如骨髓和外周血细胞)的lgG DNA的组合克隆来产生文库。这些文库已用于提供fab抗体片段，并且用于进行连续几轮淘选和成熟或修饰，以试图找到具有所需特性(例如对选定的靶标蛋白质的高亲和力或抑制生物活性)的fab抗体片段。

已从噬菌体展示pIII或pVIII抗体文库分离出抗几种靶标蛋白质的人样fab抗体。虽然已成功分离出抗特定靶标的fab抗体，但是这种噬菌体展示文库方法遇到了这样的问题，即不得不重复进行文库生成、淘选和成熟几次来分离具有所需特性的fab抗体的这么一个过程。这些噬菌体文库还遇到这样的问题：它们不能完全涵盖或模拟人类中存在的人免疫多样性的范围，包括VH/VL配对的贡献、与抗原识别相关的不同种系家族的拓扑结构特征、氨基酸变异的位点和程度以及源自不同的人种系基因的抗体的相对丰度。合成抗体与天然抗体组库(repertoire)的差异可增加不利的生化特性的风险以及如果在人中用作治疗剂的话免疫原性的风险。

需要合成的抗体文库，和在施用于人时可同时递送人治疗性抗体的高亲和力和活性、高产率、良好溶液性能以及低免疫反应倾向这些关键要素的方法。还需要相对于目前的方法提高抗体从合成文库中分离的效率，以降低发现抗体所需的资源成本，并且加速抗体的递送以供进行生物学评估。本发明的文库和方法通过将全面的设计、组装技术以及噬菌体pIXFab展示相结合来满足这些需要。

发明内容

与现有技术的教导相反的是，现在已发现pVII和pIX可成功用于生成高亲和力的fab文库，例如通过使用诱变或其他多样性产生技术并任选使用同步成熟(in line maturation)来生成，从而为治疗性抗体的fab和抗体片段生成和选择提供有效和快速的平台。根据本发明，融合到pVII和pIX的抗体可变区或fab区在噬菌体表面上参与动态的相互作用以展示功能性抗体片段即代表性的异型二聚体基序。因此，在噬菌体上展示抗体重链和轻链可变区是一种合适的和优选的方法，可用来展示和测定组合异型二聚体阵列的多样性文库，其中的成员可充当二聚的人造抗体种类，使得可以选择新型的或所需的生物活性。

本发明提供多种改进的和新的pIX和pVII噬菌体展示从头文库生成方法和组分，例如(但不限于)以下的一种或多种：(i)设计的和展示的融合到pIX或pVII噬菌体蛋白的抗体Fab从头文库；(ii)使用与M13噬菌体的广泛使用的pIII和pVIII不同的噬菌体表面蛋白；(iii)使用代表人抗体组库的序列和结构的种系VH和VL基因的小阵列；(iv)使用这些噬菌体组分作为文库支架，以在Vh和VI区的互补区中提供改进的设计的组合多样性；(v)使得可以系统性地检查设计的序列和拓扑结构对抗原识别的效果的抗体选择方法；(vi)作为文库选择的一部分的简单化的亲和力成熟和同步成熟方法。这样一个进行单个文库或群组文库的文库设计、选择、优化和成熟的新系统提供了一种供成功进行抗体从头发现的可重复并且可靠的系统，而且有利于理解抗体与抗原相互作用的结构功能关系。