[发明专利]用于从生物聚合物材料中去除杂质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从生物聚合物材料例如多糖、多肽或多核苷酸中去除内毒素例如脂多糖类的方法。通过本发明的方法能够制造包含极低水平的脂多糖的生物聚合物材料。本发明的方法非常耐用，并且不需要复杂、耗资的装置。

背景技术

脂多糖是潜在的内毒素，即在例如细菌等病原体内发现的有毒天然化合物。传统上，不同于“外毒素”，“内毒素”是不由活细菌以可溶形式分泌的毒素，而主要是当细菌裂解时释放出来的细菌的结构成分。

脂多糖类(LPS)或脂寡糖(LOS)是在各种革兰氏阴性菌的外膜中发现的内毒素的典型实例。因其历史性发现，术语LPS常与内毒素可替换地使用。在19世纪，人们明白了细菌能够向其周围环境中分泌毒素，成为广为人知的“外毒素”。术语内毒素来自于发现部分革兰氏阴性菌自身能够引起毒性，由此得名内毒素。在接下来的50多年对内毒素的研究揭示了“内毒素”的效果实际上是由脂多糖引起的。已知的唯一产生内毒素的革兰氏阳性菌是单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)。

LPS由多糖(糖)链和脂质部分(已知为脂质A，其是造成毒性作用的原因)组成。在各种不同的细菌中多糖链变化非常大。LPS在大小上具有约10kDa但可以形成高达1000kDa的大聚集体。人类在暴露于LPS之后能够产生对其的抗体，但是抗体通常针对多糖链，并不能针对多种内毒素起到保护作用。在人类志愿者中注射少量LPS导致发烧、血压降低、激发炎症和凝血。很大程度上，LPS是革兰氏阴性致病菌例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(引起暴发性脑膜炎的病原菌)导致的感染的剧烈临床表现的原因。

在药物生产中，需要从药品容器中将LPS去除，因为即使少量的内毒素也会引起人体不适但不是疾病。为了这个目的通常使用除热原炉。破坏这种物质需要大约400℃的温度。基于作为注射器或小玻璃瓶主要包装材料，250℃的玻璃温度和30分钟的保持时间通常实现内毒素水平的3log的降低。

同样，必须确保从药物级别的生物聚合物例如海藻酸盐/酯、黄原胶和明胶中去除内毒素。为此目的，现有技术中已经建议了多种方法。

WO 93/13136记载了一种纯化多糖的工艺，包括：

·使含有少于1％浓度的多糖溶液通过至少45微米孔径大小的第一硝化纤维素过滤器进行过滤；

·使所得溶液通过小于12微米孔径大小的第二硝化纤维素过滤器进行过滤；

·使得到的溶液通过小于12微米孔径大小的膜进行过滤，所述膜用多肽修饰从而结合疏水杂质；并且

·使用具有比第一超滤膜更低截留分子量的膜对所得溶液进行透析。

WO 93/13136中记载的工艺不适于加工粘性溶液并且不是很耐用。

US 5,589,591记载了一种制造高度纯化的、基本无内毒素的阿拉伯半乳聚糖组合物的方法，包括下述步骤：

(i)通过超滤，从包含阿拉伯半乳聚糖制备物中去除分子量小于阿拉伯半乳聚糖成分的分子量的材料，收集包含阿拉伯半乳聚糖的部分；

(ii)之后通过超滤从包含阿拉伯半乳聚糖的部分中去除内毒素和分子量大于阿拉伯半乳聚糖的分子量的材料；并

(iii)收集所得的包含阿拉伯半乳聚糖的部分，其已经基本不含内毒素。

上述关于WO 93/13136的内容同样适用于该美国专利。

WO 00/09566记载了一种获得超纯海藻酸盐/酯的方法，所述方法包括下述步骤：

·使用络合剂例如EDTA或活性炭对包含海藻或粗海藻酸盐/酯的溶解材料中进行提取；

·过滤溶液；

·沉淀溶液中包含的海藻酸盐/酯；并

·回收沉淀的海藻酸盐/酯。

WO 00/09566也记载了一种实施方式，其中在过滤细胞成分之前，先借助于多孔结合剂例如硅藻土、纤维素或得自再生资源的回收材料将颗粒沉淀。在该国际专利申请中所记载的方法的缺点是多孔粘合剂难以从粘性流体中沉淀，即使在加强的离心力的情况下。假如这样的粘性流体额外地显示出高的比重，几乎不可能将不溶性材料与水相分离。

US 6,451,772公开了一种制备生物聚合物组合物的方法，所述生物聚合物组合物包含具有少于约100内毒素单位/g的生物聚合物的盐，所述方法包括下述步骤：

(i)使生物聚合物盐的水溶液和疏水材料例如聚苯乙烯、聚丙烯或氟碳聚合物接触，从而将内毒素吸附在所述材料上；并

(ii)通过将溶液和水可溶性有机溶剂混合，从溶液中沉淀出内毒素含量小于约100内毒素单位/g的生物聚合物盐。