[发明专利]切割来自谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途

权利要求书

1.I-CreI变体，其特征为两个I-CreI单体中的至少一个具有至少两个替换，其中LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各有一个，所述亚结构域分别位于I-CreI的28到40位和44到77位，所述变体能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶序列，并可通过至少包括下述步骤的方法获得：

(a)构建第一系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第一功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第一功能性亚结构域位于I-CreI的28到40位，

(b)构建第二系列I-CreI变体，其在LAGLIDADG核心结构域的第二功能性亚结构域中具有至少一个替换，所述第二功能性亚结构域位于I-CreI的44到77位，

(c)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体，且(ii)+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(d)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体，且(ii)+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(e)从来自步骤(a)的第一系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体，且(ii)-10到-8位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(f)从来自步骤(b)的第二系列中选择和/或筛选能够切割突变体I-CreI位点的变体，所述突变体位点中至少(i)I-CreI位点+3到+5位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体，且(ii)-5到-3位的核苷酸三联体已被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列，

(g)将来自步骤(c)和步骤(d)的两个变体中26到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体相同，(ii)+8到+10位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-10到-8位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体相同，和(iv)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中-5到-3位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，和/或

(h)将来自步骤(e)和步骤(f)的两个变体中26到40位和44到77位的突变组合在单个变体中，获得切割以下序列的新的同二聚体I-CreI变体，所述序列中(i)+3到+5位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体相同，(ii)-5到-3位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+3到+5位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，(iii)I-CreI位点+8到+10位的核苷酸三联体被替换为存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体，和(iv)-10到-8位的核苷酸三联体与存在于来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列中+8到+10位的核苷酸三联体的反向互补序列相同，

(i)将步骤(g)和/或(h)中获得的变体相组合，以形成异二聚体，和

(j)选择和/或筛选来自步骤(i)的能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的所述DNA靶序列的异二聚体。