[发明专利]一种重组超氧化物岐化酶基因的杆状病毒及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD，Superoxide dismutase)是一种在生物体内广泛存 在的抗氧化酶。1938年Mann和Keilin在进行牛血红细胞分级分离时，发现一 种淡蓝色的含铜蛋白，但对其生理功能尚不清楚。1968年，Fricovich发现：“O₂- 使细胞色素C的还原受到一种蛋白因子抵制。1969年McCord和Fridouich证 实：该抑制因子与血铜蛋白相同。并发现血铜蛋白、肝铜蛋白、脑铜蛋白皆有 超氧阴离子自由基(O₂-)歧化活性，故命名为超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)。近十年来SOD一直是国内外专家学者研究的热点。SOD是 体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体内 超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，具有预防器官损伤、护肤、延 缓衰老等生理功能。同时SOD是一种很有用途的药用酶。

有关SOD的研究受到国内外学者的广泛关注，涉及到化学、生物、医药、 日用化工、食品诸领域。SOD临床应用主要集中在抗炎症方面(以类风湿以及 放射治疗后引起的炎症病人为主)，此外对某些自身免疫性疾病(如红斑狼疮、 皮肌炎)、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效；在食品工业主要用作食品添 加剂和重要的功能性基料；在其它方面也有相关应用。国内外已用SOD治疗氧 中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、各种炎症等多种疾病，还可作为 辐射防护剂，用于辅助放疗与化疗以及肾、肝、心脏等器官的保护和移植，以 降低大剂量辐射所引起的副作用。世界各国都研制开发出许多富含SOD的食 品、饮料、化妆品、护肤品，以及具有增白、恢复青春、延缓衰老作用的保健 品。

目前国内SOD的生产工艺基本上以动物血或植物为原料，以Mccord和 Fridovich法提取SOD，包括以下三个步骤：乙醇-氯仿除去血红蛋白；有机溶 剂和硫酸铵分级沉淀；离子交换柱层析纯化。这些方法安全性不高，易导致动 物病毒交叉感染，欧盟已于1999年颁布法令，禁止从动物血液中提取的SOD 用于人类。另外，这些方法获得最终产物量少，一般情况下，1公斤血液只可 提取SOD 0.08克左右。

杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首 次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(smith，Mol Cell Biol.3：2156.2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国 就有α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、 慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒 糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。杆状病毒包括 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BssNPV、EOSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、 MbMNPV、UpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等，昆虫宿主包括家蚕、 野蚕等。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕杆状病毒表达系统是世 界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。

本发明利用家蚕生物反应器高效表达嗜高温菌中稳定存在的SOD，在70℃ 热处理后便可除去大部分杂蛋白，获得高活力SOD，简化了SOD生产的工艺 流程，降低其生产成本，SOD在一条蚕蛹中的表达量最多可达到1mg，远高于 传统的生产方式，具有重要的科研和产业化价值。

发明内容

本发明提供一种重组杆状病毒及其制备方法。

本发明还提供本发明所述的重组杆状病毒在制备嗜高温菌SOD蛋白中的 应用。

一方面，本发明提供一种重组杆状病毒，该病毒含有嗜高温菌SOD基因， 所述SOD基因序列如SEQ ID NO.1所示。所述重组病毒可接种家蚕，表达嗜 高温菌SOD蛋白，当然，本发明的重组杆状病毒不仅可以接种家蚕，还可接种 其它昆虫。

同样，利用别的杆状病毒表达系统，如AcMNPv、ApNPv、等也可按同样 的方法表达生产。用基因重组技术，将SOD基因在多角体启动子或别的病毒和 真核生物的强启动子的控制之下，通过体内或体外重组，将SOD基因整合到杆 状病毒的基因组上，得到重组病毒。