[发明专利]用于检测食品和饲料中花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子的引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导等温扩增技术进行转基因产品快速筛选的方法，具体是一种快速检测转基因植物常用启动子花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子所用的引物序列。

背景技术

自1983年第一例转基因作物问世以来，转基因技术在农业各领域得以迅速应用与发展。全球转基因作物品种不断增加，种植面积已累计达到6.9亿公顷。采用转基因技术，可对农作物的质量、数量进行精确的改良和提高。转基因作物在产量、抗逆能力(包括抗病、抗虫、抗冻、抗除草剂)和营养品质等方面较传统作物有显著改进，可大大降低生产成本，缓解环境的不断恶化。在享用转基因技术带来的巨大实惠的同时，转基因产品潜在的生态安全、食品安全问题也日益引起人们关注，各国纷纷制定相应的法律法规对转基因产品进行监管。除美国、加拿大、阿根廷、和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上大多数国家如欧盟各国、匈牙利、瑞士、波兰、日本、韩国等均制定了强制性标识制度。我国于2001年、2002年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，启动了农业转基因生物的监督监管机制。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因作物，应当加以标识，未标识和不按规定标识的，不得进口和销售，因此，必须对转基因产品进行有效的检测。

在利用基因工程技术将一个外来基因整合进入植物细胞时，外来基因必须配备一个启动子。启动子是决定基因表达部位、时间、强度的主要调控元件。花椰菜花斑病毒CaMV的35S启动子能在许多植物物种中，几乎所有发育阶段及所有组织中高效表达，被广泛用于构建转基因植株，如玉米、棉花、大豆、番茄等，大约有85-90％的转基因植物使用了该启动子。35S启动子有很多版本，但其保守序列相当稳定，是转基因检测的最佳靶点。通过检测CaMV35S启动子，可筛选产品中是否含转基因植物成分，

目前转基因产品的检测，主要采用蛋白检测和DNA检测的方法。两类方法，对于不同产品中转基因成分的检出和定量检测，各有优、缺点。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在产品成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受产品基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样易受加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，主要采用聚合酶链式反应(PCR)，该方法灵敏、特异，但需要昂贵的试剂和仪器。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)技术，是一种新型的体外恒温核酸扩增方法，具有高特异性、高效率和快速灵敏的特点，可以大量扩增所需的靶序列。实验结果可通过使用染料，在日光下肉眼直接判定。该方法只需要极少的试剂费用和一个水浴锅即可完成绝大多数检测过程，是真正普及型的核酸检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子，设计一组特异性引物，进而建立一种快速筛选转基因产品的方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些产品检测中的局限性，为转基因产品检测提供有效工具，从而加强转基因产品的监督监管，确保产品标签的一致性，保护消费者的知情权和选择权。

本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹-10¹⁰拷贝。扩增结果可通过荧光染料染色肉眼观察。

本发明涉及的花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子环介导等温扩增检测用的引物，其序列如下：

(1)上游内引物(FIP)：5′-AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC-3′；

(2)下游内引物(BIP)：5′-TAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGTCTCAGAAGACCAAAGGGC-3′；

(3)上游外引物(F3)：5′-TCCATCTTTGGGACCACTGT-3′；