[发明专利]一种利用RNA干涉技术降低曼地亚红豆杉细胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法

权利要求书

1.一种利用RNA干涉技术降低曼地亚红豆杉细胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

a)从红豆杉中克隆得到14β羟基化酶基因(简称14OH)片段；

b)构建RNA干涉载体，载体宿主菌为根癌农杆菌；

c)转化红豆杉愈伤组织，转化条件为将含有目的RNA干涉载体的根癌农杆菌活化稀释，转化对数生长期悬浮培养一天后的红豆杉愈伤组织，共培养2-3天后，清洗，转入含有抗生素的培养基中培养；

d)PCR和southern检测转基因细胞；

e)C-14氧取代的紫杉烷含量分析。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于C-14位氧化紫杉烷为sinenxan A、sinenxan C和Yunnanxane。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于构建RNA干涉载体所用的14OH基因的引物是：

5’-GCGGAATTCTAGAATGGATGTCTTTTATCCGTTAA-3’(正义链)

5’-GCTGGATCCATGAAGCAGCCCGGAAAAGTTGTC-3’(反义链)。

4.根据权利要求1所述的有效降低曼地亚红豆杉细胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于根癌农杆菌活化步骤如下：

a)在LB+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的培养基上筛选携带外源基因的农杆菌GV3101；

b)挑取该单菌落置于2ml LB液体培养基中，28℃，250rpm条件下培养两天；

c)取培养后的菌液250ul放入25ml LB液体培养基中，28℃，250rpm条件下培养过夜。

5.根据权利要求1或4所述的有效降低曼地亚红豆杉细胞C-14位氧化紫杉烷含量的方法，其特征在于：载体宿主菌为根癌农杆菌GV3101。

6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：曼地亚红豆杉细胞生长和转化所采用的培养基为6，7-V培养基。

7.根据权利要求1所述方法，其中C-14氧取代的紫杉烷含量采用HPLC方法分析。