[发明专利]抗结核杆菌感染的小分子核苷酸DNA适配子及其制备方法

说明书

原案申请日：2006年07月20日

原案申请号：200610019671.8

原案发明名称：抗结核杆菌感染的小分子核苷酸DNA适配子及其制备方法

技术领域

本发明属微生物感染免疫和检验领域，具体涉及一种能抑制感染人的结核杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，H37Rv)[ATCC93009(4)]的DNA适配子(Aptamer)，具有SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。同时还涉及制备一种能与感染人的结核杆菌特异结合，抑制结核杆菌感染的高亲和DNA适配子的方法。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)感染人体导致的结核病是一种严重危害人民身体健康的慢性传染病。结核病是历史上患病率及死亡率最高的疾病之一。上世纪50年代以来，结核病的流行在一定程度上得到了控制。80年代中期以来，由于耐药结核菌的流行和艾滋病的传播蔓延等因素，使一些已经控制了结核病疫情的国家出现了疫情进一步加重或扩散流行的局面，结核病疫情又有进一步抬头的趋势。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球目前有近三分之一的人感染结核杆菌，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结核病，新增患者880万人。1993年，世界卫生组织宣布“全球结核病处于紧急状态”，把结核病列为重点控制的传染病之一。我国是结核病高负担国家，国务院已确定结核病为我国三大重点防治传染病之一。因此，加强对结核病的研发力度，急待研制新型抗结核新药，以便对该病进行有效的治疗和预防，具有很大的研究价值和社会效益。

SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，基本原理是运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，应用范围十分广泛。已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和性和特异性，具有良好的应用前景。适配子与传统意义上抗体相比，具有分子量小，能更快地渗入细胞，更迅速在血液中清除，能够稳定合成，便于修饰等特点。是极有潜力的作为预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。本研究中，我们采用SELEX技术对H37Rv进行筛选，并用BCG进行反筛，以获得能拮抗结核分枝杆菌表面毒力成分的生物活性小分子核苷酸Aptamers分子。为结核杆菌感染机制的研究，结核病治疗性新型药物和新型诊断试剂的开发而奠定基础。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，该DNA适配子为预防和治疗结核病提供了新型的拮抗剂，可以克服临床常用药物利福平(rifampin)、链霉素(streptomycin)等治疗周期长，副作用大的缺点。

本发明的另一个目的是提供一种制备能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的方法，该方法通过随机单链DNA文库和引物的构建、合成双链DNA文库、PCR扩增、SELEX筛选、体外抑制细菌侵袭实验，得到能抑制结核杆菌感染小鼠的DNA适配子，并通过动物实验检测效果好，准确率高。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.1，SEQIDNO.2，SEQIDNO.3，SEQIDNO.4，SEQIDNO.5，SEQIDNO.6，SEQIDNO.7，SEQIDNO.8，SEQIDNO.9，SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。

一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的制备方法，按下列步骤顺序进行：