[发明专利]一种含有原核基因pprI的真核重组质粒及其用途

说明书

技术领域

本发明属于基因重组载体领域，尤其涉及含有原核基因pprI的真核重组质粒及其用途。 

背景技术

随着核科学技术的迅猛发展，核辐射已广泛用于国防、工业、农业和医学等各个领域造福于人类。然而，无论在平时还是战时，核爆炸、核恐怖、核事故等核突发事件所产生的大剂量电离辐射，对生物机体可引起严重的急性放射性损伤(ARI)，死亡率极高。急性重度放射损伤的防治一直是国际放射医学和国防医学领域研究的重点和难点之一。 

近年来，随着分子生物学和蛋白质工程学研究的迅速发展和应用，细胞因子已试用于急性放射损伤的临床救治。我们的研究表明，放射损伤时细胞因子分泌显著降低或相对低下，是放射损伤难以修复的主要原因之一。细胞因子的持续可控性释放，可能是治愈急性放射损伤的关键。 

目前应用细胞因子蛋白或质粒的方式主要为皮下或肌肉注射，由于细胞因子蛋白价格昂贵、在生物体内半寿期短、而增加注射频率或增大用药剂量，则易产生严重毒副作用而使病人无法耐受。这些弊端限制了细胞因子在放射损伤临床中的应用。 

抗辐射菌(Deinococcus radiodurans)是1956年由美国科学家Arthur WAnderson等人首次从辐射灭菌后变质的肉类罐头中分离出来的需氧型、非孢子型、革兰氏阳性四联体微球菌，是迄今为止地球上发现的辐射抗性最强的微生物之一。因其对电离辐射、紫外线等辐射引起的致死和突变效应具有极强抗性，近年来倍受生物医学界和环境工程界的关注和重视。抗辐射菌能在辐照后几小时内准确无误地修复每条染色体至少150多个DNA双链断裂(DSB)。指数生长期的抗辐射菌对电离辐射的抗性是大肠杆菌的200倍，可耐受几百Gy电离辐射的照射。这种极强的抗辐射能力可能与该菌染色体的环状紧密结构、高效精确的DNA损伤修复系统尤其是对双链DNA断裂极强的修复能力有关，也可能与抗辐射菌胞质锰(cytosolicmanganese)的高含量和铁的低含量能够保护蛋白(而不是DNA)免遭电离辐射引起的氧化损伤有关。

促DNA修复多效蛋白诱导因子(inducer of pleiotropic proteins promotingDNA repair，pprI)是一种在抗辐射球菌新发现的调节蛋白。pprI基因含有987bp，编码328个AA，其产物PprI的分子量约为37KD。pprI在抗辐射菌的抗放作用中起着十分重要的作用，它能刺激辐射后recA基因转录增加。pprI作为一个开关基因，可能通过调节recA、pprA等下游基因的表达而加速DNA电离辐射损伤的修复。研究表明，抗辐射菌的PprI蛋白在大肠杆菌中表达可使大肠杆菌对高剂量的γ射线的辐射抗性及抗氧化能力都明显提高。 

抗辐射菌属原核生物，与真核生物哺乳动物在进化上存在着巨大差异，基因组成和蛋白表达不同，并且存在密码子的偏爱性问题。因此，原核基因在哺乳动物细胞中表达几乎是不可能的。哺乳动物细胞不含pprI基因或同源类似物，那么能否将抗辐射菌pprI基因导入哺乳动物细胞，并且该基因能否表达和发挥其抗辐射损伤的作用呢？这一科学难题迄今在国内外文献中尚未见有关报道。 

发明内容

本发明目的是提供一种含有原核基因pprI的真核重组质粒，从而使pprI原核基因在真核细胞中成功表达，实现pprI基因在两大种系间的跨越和蛋白表达；本发明的另一目的是提供含有原核基因pprI的真核重组质粒的用途。 

为达到上述目的，本发明具体技术方案是，一种含有原核基因pprI的真核重组质粒，所述重组质粒为pCMV-HA-pprI，将该质粒转化到大肠杆菌中保藏，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：中国武汉大学；保藏日期2008年12月11日；保藏编号CCTCC M 208253；分类命名：大肠杆菌DH5α/pCMV-HA-pprI；Escherichia coli DH5α/pCMV-HA-pprI； 

上述技术方案中pCMV-HA-pprI重组质粒的构建，包括以下步骤： 

(1)以5’-ATGCCCAGTGCCAACGTCAGCCCCCCTT-3’为上游引物，5’-TCACTGTGCAGCGTCCTGCGGCTCGTCC-3’为下游引物，以D.radiodurans R1基因组为模板，PCR扩增得到pprI基因； 

(2)回收步骤(1)所得PCR产物，与pGEM-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑选阳性克隆，抽提质粒；