[发明专利]猪瘟间接血凝检测试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪瘟抗原重组蛋白制备方法及用这种猪瘟抗原重组蛋白制备间接血凝检测试剂盒的方法及试剂盒。

背景技术

猪瘟是严重威胁养猪业，造成重大经济损失的病毒性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类16种法定传染病之一。1999年2月12日我国农业部发布的第96号公告也将猪瘟列为一类动物疫病。

到目前为止，猪瘟已经存在了近2个世纪，虽然世界各国对该病的防制都做了巨大努力，而且在北美、欧洲和北欧的一些地区还成功地消灭了猪瘟，但猪瘟在世界许多地区仍广泛传播，并且其流行和发病的特点已发生了很大变化，许多病例属于温和型和隐性感染、持续感染，症状不典型，这给准确诊断带来了难度，不能及时将这些病猪隔离。它们作为传染源在猪群中存在，又导致更多的猪发病，从而使防制工作更加困难。

对于猪瘟的防制，目前除了欧盟成员国禁止使用疫苗之外，其它世界各国仍以弱毒疫苗免疫为主。经过多年实践应用，公认安全有效、没有残余致病力的弱毒疫苗株有三种：(1)中国“54-III系”，又称C株兔化弱毒疫苗；(2)日本GPE-细胞弱毒疫苗；(3)法国培育的“Thiveosal”冷变异弱毒株。猪瘟弱毒疫苗在全世界的广泛应用对控制和消灭猪瘟起到了及其重要的作用，但这也给有效检测猪瘟野毒感染增加了难度，因为疫苗免疫过的猪群普遍具有高滴度的CSFV抗体。

为了消灭猪瘟，需要快速而准确的诊断技术，世界各国对猪瘟的实验诊断都进行了大量研究，分为检测病毒抗原和检测病毒抗体两个方向。检测病毒抗原的方法主要有动物接种试验、琼脂扩散试验、免疫荧光试验、血清中和试验、新城疫病毒强化及RT-PCR法等。检测病毒血清的方法主要有血清中和试验、酶联免疫吸附试验、正向间接血凝试验、间接免疫荧光试验等，参见《动物病毒学》，殷震，刘景华主编，1997年第二版，科学出版社出版。但常规血清学方法不能区分疫苗株和野毒感染产生的血清抗体。

另外，由于CSFV与牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)具有共同的可溶性抗原，在血清学上与BVDV有交叉反应。在自然状态下，BVDV可以感染猪，因此这些感染猪中存在抗BVDV的血清抗体。目前，除用分别针对CSFV和BVDV的单克隆抗体区分它们外，用猪瘟全病毒抗原检测血清抗体的常规免疫学方法均不能区分BVDV感染。

发明内容

本发明提供一种制备猪瘟抗原重组蛋白的方法，和这种猪瘟抗原重组蛋白，这种猪瘟抗原蛋白可克服现有技术的不足，仅与CSFV抗体发生反应但不与BVDV抗体发生交叉反应；本发明同时提供用这种重组蛋白制备检测试剂盒的方法，以及用前述的方法制备的试剂盒。

本发明的猪瘟抗原重组蛋白的制备方法是从猪瘟病毒(CSFV)基因的保守区中选取一段与牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)基因同源性低于35％的60个核苷酸的序列S1，其对应的氨基酸序列为A1，所选的序列A1中至少包括1个能刺激动物机体产生中和抗体的抗原位点，同时要求所选择的核苷酸序列中的密码子应尽可能地不存在稀有密码子或亚稀有密码子，再将其中的第4个氨基酸改变为亲水性氨基酸，得到氨基酸A2，然后在不改变氨基酸序列的情况下对A2对应的核苷酸序列S2进行改变，分别得到另外3段与S2的密码子不同并尽可能地避免了稀有密码子或亚稀有密码子出现的，而且为大肠杆菌所偏爱的新的核苷酸序列S3、S4、和S5；选用其编码的氨基酸自身内以及与氨基酸A2的单个氨基酸间均不形成共价键的联接核苷酸S6，以避免后续表达的抗原蛋白形成二级结构而影响抗原的反应原性，然后在保证其编码的氨基酸序列不改变，尽可能地避免稀有密码子出现以及核苷酸序列尽量不重复的原则下进行人为改变得到联接核苷酸S7和S8。以S2、S6、S3、S7、S4、S8和S5的顺序依次进行串联，得到序列S9，其对应的氨基酸序列为A3，在序列S9前面添加限制性内切酶位点BamH I及保护性碱基，在后面添加限制性内切酶位点Xho I及保护性碱基，所得核苷酸序列S10，将序列S10进行人工合成，然后将其用BamH I和Xho I进行双酶切，得到的目的基因片段与同样用BamH I和Xho I进行双酶切后得到的载体pGEX-4T-1序列进行连接，然后将重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行诱导表达，从表达产物中分离纯化得到重组蛋白。