[发明专利]应用同源重组定向克隆和亚克隆的方法和组合物

说明书

本申请是申请日为2000年7月10日的中国专利申请00812739.5“应用同源重组定向克隆和亚克隆的方法和组合物”的分案申请。

1.技术领域

本发明涉及应用细菌重组酶介导的同源重组技术进行DNA克隆和亚克隆的方法和组合物。在一个具体实施方案中，应用RecE/T或Redα/β重组酶，或任何功能等价系统启动细菌同源重组，如来自噬菌体P22的erf。具体地说，本发明涉及克隆方法，诊断方法，含有用作克隆载体的多核苷酸的组合物，含有所述多核苷酸组合物的细胞，以及由RecE/T和Redα/β介导的克隆试剂盒。

2.背景技术

在大肠杆菌中进行DNA克隆和亚克隆是分子生物学的基础。DNA克隆是指一个过程，其中一个复制起点操作性连接于双链DNA片段，并在大肠杆菌或其他适宜宿主中扩增。DNA亚克隆也是指一个过程，其中双链DNA片段取自一个业已扩增的DNA分子，所述扩增可以在体外进行，如通过PCR，也可在体内进行，如在大肠杆菌或其他适宜宿主中扩增，然后将该DNA片段操作性连接于复制起点。在大肠杆菌中进行的典型克隆和亚克隆是将DNA片段的末端与线性化载体末端连接，所述载体包括大肠杆菌的复制起点和可选择标记。载体包括的可选择标记可以确保新克隆的产物、含有插入片段的质粒在导入其宿主细胞大肠杆菌时，可以保留并扩增。

传统的克隆方法具有某些局限性。例如，因为传统的克隆方法需要应用限制性酶，因此DNA片段的选择就受到一定限制，即目标DNA区域内必须有限制性酶的识别位点。限制性位点必须使酶切位于所需DNA片段之外，而不能存在其中。由于绝大多数有用的限制性酶发挥作用相当频繁，因此所得线性DNA片段的大小也受到限制。

应用聚合酶链反应(PCR)产生DNA片段是传统亚克隆的第二个主要缺陷。PCR产物的末端不能用于连接反应，因为耐热聚合酶在扩增的PCR产物3’末端添加了非模板核苷酸。而且，应用PCR还具有突变的高风险。因此，分子生物学家正在寻求新的更加有效的克隆DNA片段的方法，特别是当这些片段比通过传统的限制性酶或PCR方法所能获得的片段长时。

同源重组是克隆和亚克隆DNA片段的另一种替代方法。在含有宿主同源重组系统的大肠杆菌中亚克隆PCR产物的方法业已有述(Oliner etal.，1993，Nucleic Acids Res.21：5192-97；Bubeck et al.，1993，Nucl.Acids.Res.21：3601-3602)。在这些方法中，用于扩增目标DNA片段的PCR引物，被设计为含有的末端序列与线性化的载体末端序列同源。然后将PCR产物和线性化载体导入大肠杆菌。在大肠杆菌宿主细胞中进行的同源重组使PCR产物序列插入到质粒载体中。尽管这些方法业已显示可以用于亚克隆PCR片段，但它们还没有用于亚克隆较长的DNA片段，或者克隆任何大小的DNA片段。

另一种描述的体内亚克隆方法是应用两个线性DNA分子转化大肠杆菌sbcBC宿主细胞，这两个DNA分子中的一个具有复制起点，两个分子在其末端都有较长的同源区域。同源重组在体内发生，导致新形成的质粒的环化和增殖(Degryse，1996，Gene 170：45)。然后，大肠杆菌sbcBC宿主细胞介导同源重组的这种能力，又用于亚克隆来自腺病毒和疱疹病毒基因组DNAs的大型DNA片段(Chartier et al.，1996，J.Virol.70：4805；Messerle，et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，14759-14763；He，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2509-2514)。如其所述，通过在大肠杆菌sbcBC宿主细胞中进行同源重组需要至少两个预先准备的亚克隆步骤，使较长的同源区域位于大肠杆菌复制起点的两侧。而且，还没有文献表明可以在大肠杆菌sbcBC菌株中进行DNA克隆。