[发明专利]组件式限制性内切核酸酶在产生具有新的特异性的酶中的应用

权利要求书

1.制备具有改变的特异性的II型限制性内切核酸酶的方法，包括：

(a)选择被表征为具有特异性亚基和催化亚基的组件式结构的限 制性内切核酸酶，所述特异性亚基还包括用于结合二重识别序列的一 半位点的N-端结构域和用于结合所述二重识别序列的另一半位点的C- 端结构域；

(b)修饰所述特异性亚基；和

(c)得到所述具有改变的特异性的II型限制性内切核酸酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述限制性内切核酸酶选自 具有包括特异性亚基和催化亚基的组件式结构的一组酶，所述特异性 亚基还包括用于结合二重识别序列的一半位点的N-端结构域和用于结 合所述二重识别序列的另一半位点的C-端结构域。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)中的修饰所述特异 性亚基还包括，用第二C端结构域取代所述N端结构域或用第二N端 结构域取代所述C端结构域。

4.根据权利要求1所述的方法，其中修饰所述特异性亚基还包括， 用来自第二限制性内切核酸酶或甲基转移酶的结合结构域取代所述N 端结构域或所述C端结构域或N端结构域和C端结构域。

5.根据权利要求1所述的方法，其中修饰所述特异性亚基还包括， 突变所述N端结构域、所述C端结构域或这两个结构域，以改变结合 特异性。

6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中修饰所述特异 性亚基还包括，改变所述特异性组件的所述N端结构域和C端结构域 之间的间隔氨基酸序列的长度。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述第二限制性内切核酸酶 或甲基转移酶选自I型限制性内切核酸酶、IIG型限制性内切核酸酶和 γ型m⁶A甲基转移酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述特异性亚基和所述催化 亚基由不同的基因编码。