[发明专利]海藻糖合成酶及其编码基因与它们的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种海藻糖合成酶及其编码基因与应用。

背景技术

海藻糖由两个吡喃环葡萄糖以1，1-糖苷键连结而成，是一种非还原性二糖。海藻糖有 3种光学异构体，其中αβ和ββ型在自然界中很少存在，αα型是最常见的海藻糖，α α型海藻糖结构式如式I所示。

(式I)

海藻糖无色无嗅，口感略带甜味，其甜度相当于蔗糖的45％。海藻糖的理化性质稳定， 不会焦糖化，不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，但能被海藻糖酶水解为两个 葡萄糖分子。

海藻糖的制备方法：传统方法有化学合成法和微生物抽提法，特别是酵母提取法曾经 是海藻糖的主要商品生产方式。但这些方法产品收率低，制造成本过高，价格昂贵，近年 来已经逐步被淘汰。

海藻糖的生物合成途径有5种，磷酸化酶法利用转基因植物生产海藻糖，有关研究在 国内外也颇为活跃。荷兰植物生物技术公司将编码大肠杆菌的6-磷酸海藻糖合成酶和6-磷 酸海藻糖酯酶的基因OtsA和OtsB导入甜菜、马铃薯基因组中，然后从块茎中提取海藻糖。 其缺点是目前块茎中海藻糖的含量还不够高。酶转化法是制备海藻糖的新方法。1990年意 大利M De Rosa小组首先发现了能够将淀粉水解物转化为海藻糖的酶，但未申请专利。1994 年日本林原生化研究所发明了用两种酶，即麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡 糖基海藻糖基海藻糖水解酶(MTHase)，协同作用，由淀粉直接酶法生产海藻糖。配合其 它淀粉水解酶，海藻糖转化率可达70％。1995年林原公司实现了双酶转化法的工业化生 产，是当时海藻糖生产方法中成本最低的途径。

酶转化法分为两种：双酶法和单酶法。单酶法是由TreS基因编码的海藻糖合成酶通过 分子内转糖基作用，可把海藻糖转化为麦芽糖：

双酶法首先由MTSase作用于麦芽糊精末端，催化分子内的转糖基化，形成麦芽寡糖 基海藻糖。然后在MTHase作用下断裂麦芽寡糖和海藻糖间的α-1，4-糖苷键，释放出海藻 糖。编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因分别是TreY和TreZ。

这两种酶系在自然界的微生物中广泛存在，至少有15个菌属含有上述单酶或双酶系， 但主要存在于古细菌、极端环境微生物中，或是在极端环境下诱导生成。关于海藻糖生成 和代谢机制的研究一直是极端微生物(Extremophiles)研究的热点课题，在Nature，Science等 顶级杂志上常有相关论文，也有大量研究课题，如近年的欧盟课题QLK1-CT-2000-01376； POCTI/BIO/48333/2002.有大量关于海藻糖合成酶系的基因工程表达研究，但海藻糖合成酶 基因的编码特征特殊，在异源生物中不易表达，或表达量偏低，因此虽然有大量论文发表， 但很少有依据基因工程表达申报的专利公开，据此推测相关技术尚待研究开发。

经过联网检索，关于海藻糖的酶法转化共检索到23个专利。其中林原生化研究所的国 际专利01100417.7是日本生产海藻糖的主要方法。南宁中诺生物工程有限责任公司申请的 中国专利200410013006.9公开的一种海藻糖合成酶，在40L发酵罐水平上表达，以27.27％ 的麦芽糖为底物，转化时间32h，转化率70％。是目前国内生产海藻糖的主要方法。中国 专利200410013007.3、200410013008.8结果类似。

工业化生产：1995年日本林原Hayashibara公司首先实现了双酶法规模化生产海藻糖， 大幅降低了生产成本和产品价格。目前海藻糖生产生产企业主要有日本林原研究所、美国 Cargill公司、广西南宁中诺公司。其中广西南宁中诺公司通过选用木薯淀粉做原料，优化 转化工艺，已经将海藻糖的价格降低到25000元/吨。

长期以来制约海藻糖广泛应用的根本原因是生产成本偏高。由于海藻糖和麦芽糖一样， 都由淀粉二步转化生成：麦芽糖由淀粉酶和糖化酶转化，海藻糖由麦芽寡糖基海藻糖合成 酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶转化，因此一旦海藻糖生产酶的产量、生产成本和效率能够 和麦芽糖生产酶的一样，海藻糖的价格就可以和麦芽糖一样，其的产品竞争力和市场份额 将非常巨大。

发明内容

本发明的目的是提供一种海藻糖合成酶及其编码基因与应用。