[发明专利]骨保护素-热休克蛋白65融合蛋白的制备及其应用

权利要求书

1.一种制备OPG-HSP65融合蛋白的新方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码OPG、其变体或片段的核苷酸序列和编码HSP蛋白、其变体或片段的核苷酸序列可操作地连接于表达载体中，得到OPG-HSP65融合蛋白的重组表达载体；

(b)将步骤(a)中的重组表达载体转化入大肠杆菌中，并筛选获得表达OPG-HSP65融合蛋白的工程菌；

(c)在合适的条件下发酵培养诱导表达融合蛋白；

(d)从步骤(c)中的培养产物中纯化分离所述融合蛋白；其中所述融合蛋白的形式为R1-L-R2形式，其中R1为OPG蛋白、或其变体或片段；R2为HSP蛋白、或其变体或片段；L为接头蛋白。

所述OPG蛋白，或其变体、片段选自：

(1)SEQID No.1所示的蛋白序列；

(2)氨基酸序列22-X，其中X为SEQIDNo.1所示的包括位置185-401的任意氨基酸残基。

所述的HSP65蛋白、或其变体或片段选自：

(1)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；

(2)氨基酸序列ALSTLVVNKIRGTFK。

所述L接头选自：

(1)ala-(ala)n-ala，n可以是1～4间的整数；

(2)gly-(gly)n-gly，n可以是1～4间的整数；

(3)gly-pro-gly；

(4)gly-gly-pro-gly-gly；

(5)ser-gly-(gly)n-gly，n可以是1～4间的整数；

(6)val；

(7)tyr-val；

(8)亚部分(1)-(7)的任何组合。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)包括重组克隆质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单菌落接种于25mL LB培养基(含25mg/L卡那霉素)，37℃振荡培养过夜。次日取50ml过夜培养物转接于1L LB培养基(含25mg/L卡那霉素)中，37℃培养至OD₆₀₀至0.5，加入IPTG使之终浓度为1mmol/L，30℃继续振荡培养5h后离心收集菌体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)包括采用包涵体的溶解，稀释复性及分子筛层析纯化，获得目的蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列22-X是第22-194为氨基酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合蛋白潜在用于类风湿关节炎的治疗。