[发明专利]一种海洋溢油生物毒性快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种海洋溢油生物毒性快速检测方法。

背景技术

随着工业化进程的加快，人们对石油的依赖越爱越大，使港口和沿海油轮密度增大，使得原已十分繁忙的通航环境更加复杂，导致船舶溢油污染的风险增大。近几年的溢油事件造成了大面积的海洋污染，给海域的生态环境带来巨大的损失，已经引起了人们的重视。目前对于油品毒性的检测很大程度上依靠化学手段和动物实验，但是这种方法价格昂贵、需要很多动物，而且费时。因而近年来更倾向于一种快速、简便的方法，发光细菌的毒性检验方法就是符合这些要求的生物检测方法之一。目前我国已经制定了发光细菌的水质检测标准(GB/T15441-1995)，国内外的一些学者也通过发光细菌对一些油品的生物毒性进行了检测，但是由于实验采用的发光细菌是从海洋中提取来的，而在以往的检测过程中都是利用纯水作为配制水融合组分的溶剂，这样就改变了发光细菌的盐度，给结果来了一定的影响。

发明内容

本发明针对上述问题，提供了一种海洋溢油生物毒性快速检测方法，它通过人工海水作为水融合组分制备的溶剂，并采用半数效应载荷率EL₅₀作为油类在水中生物毒性的判定标准，使难溶的油类的生物毒性判定更加科学和准确，从而实现油品生物毒性的分级。

本发明的技术方案是：一种海洋溢油生物毒性快速检测方法，具体步骤如下：

一、发光细菌的培养

菌种采用明亮发光杆菌T3变种，制备发光菌新鲜菌悬液：

(1)斜面菌种培养：在新鲜斜面上接出第一代斜面，25℃±0.5℃培养24h后立即转接第二代斜面，25℃±0.5℃培养24h后再转接第三代斜面，25℃±0.5℃培养24h后备用。

(2)摇瓶菌液培养：取第三代斜面菌种近一环，接种于装有30ml细菌培养液的100ml三角烧瓶中，25℃±0.5℃，160r/min下培养24h备用。

(3)将培养后的发光细菌菌悬液稀释至每毫升10⁸个～10⁹个细胞，初始发光度不低于800mV，备用。

斜面和菌液的营养基为：

胰蛋白胨 0.5g  NaCl 3g     Na₂HPO4  0.5g   KH₂PO4 0.5g

酵母     0.5g  甘油 0.3g   蒸馏水   100ml  固体培养基加琼脂 1.69g

二、水融合组分的制备

在毒性试验中实际评定的是油类在水中溶解的成分和在水相中稳定存在的小油珠部分，既水融合组分水溶合组分。我们将配置好的人工海水作为水溶合组分中的水溶液和稀释水溶液。人工海水的配方为：

NaCl          20g

MgSO₄         3.6g

MgCl          7.2g

无水CaCl₂     0.7g

蒸馏水        1000ml

油类在水中的载荷率可以直接根据单位体积溶液添加的材料的重量(W/V)为基础进行添加。设置10g/L、8g/L、6g/L、4g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L等7个载荷率梯度。

如果试验材料比水密度小，应采用从容器底部搅拌试验材料的搅拌器，而对于那些密度比水大的试验材料，则应采用从容器顶部搅拌试验溶液的搅拌器，搅拌器的搅拌速度应该适当、匀速，一般液面漩涡的深度为水溶合组分溶液制备容器中试验液高度的10％-35％。对于同一种油溶液水溶合组分的制备，搅拌速度应相同。搅拌时速度不要太快，速度在1200-1500rpm/min为宜，防止乳化现象的产生。

在制备水溶合组分溶液时，为了使油与水充分融合，需要一定的搅拌时间，随搅拌时间的延长，水中油的含量增加，但增加量逐渐平缓。一般需要搅拌24h，搅拌后，为使混合液中非分散的油成分与已分散和溶解组分分离，应静置4h。

在为一种油制备不同载荷率的水溶合组分时，必须用一个载荷率制备一种水溶合组分，不能仅制备一种水溶合组分，经过稀释后制成试验用水溶合组分系列，因为试验材料在较低载荷率时，各种成分的溶解度不同。

三、发光细菌相对发光度的测定

测定时的室温要控制在20～25℃，同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过±1℃。取若干试管，给每支作为对照管的试管加1.98ml的人工海水，给每支作为样品管的试管加1.98ml的水溶合组分溶液。向每管中加入步骤一制备的备用的发光细菌菌液0.02ml，放入发光光度计中检测。