[发明专利]重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组金针菇免疫调节蛋白，尤其是涉及一种使用巴斯德毕 赤酵母(Pichia pastoris)进行表达的重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应 用，属于生物药工程领域。

背景技术

真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein，FIP)最早是从灵芝子 实体中提取获得的一种小分子蛋白质(命名为LZ-8，Kino et al.，1989，J Biol Chem， 264：472-478)，具有刺激外周血淋巴细胞增殖，诱导白介素和干扰素等细胞因子 分泌，促进核酸和蛋白质合成，抑制过敏反应，进而增强机体免疫力等功能。 目前已从六种食、药用真菌中获得了这种真菌免疫调节蛋白质，分别是赤灵芝 (LZ-8)，松杉灵芝(FIP-gts)，金针菇(FIP-fve；Ko et al.，Eur J Biochem，1995，228： 244-249)，草菇(FIP-vvo)，紫芝(FIP-gja)和小孢子灵芝(FIP-gmi)，形成了FIP家 族。这六种真菌免疫调节蛋白之间有较高的同源性(60％～70％)和相似的免疫学活 性，具有与凝集素和免疫球蛋白相似的结构。真菌免疫调节蛋白能够凝集血细 胞，促进小鼠脾淋巴细胞和人外周血淋巴细胞增殖，抑制多种过敏性反应，降 低抗体产生，对抗小鼠足垫水肿和移植组织的排斥反应。其免疫调节活性主要 表现为可促进免疫细胞增殖并促进T淋巴细胞分泌多种细胞因子(白介素-2、肿 瘤坏死因子和干扰素IFN-γ等)。另外，真菌免疫调节蛋白具有抗病毒和细菌感 染，对多种肿瘤细胞具有抑制生长或者直接杀伤作用。

金针菇免疫调节蛋白FIP-Fve由114个氨基酸残基组成，分子量为12704Da， 不含组氨酸，半胱氨酸和甲硫氨酸。其一级和二级结构与人类免疫球蛋白重链 可变区相似，为单纯蛋白质，不含糖基。利用NaBr渗透对FIP-fve进行单向不 规则的晶体衍射方法揭示报道了其结构，发现对于FIP-fve活性起重要作用 的二聚化是由于N端α螺旋的三维交换形成，其二聚化主要靠疏水作用稳定 (Paaventhan et al.2003，J Mol Biol，332：461-470)。

FIP-fve是一种有丝分裂原，作为一种激活剂，具有促进外周血单核细胞周期 G0/G1向细胞周期S发展，进而促进淋巴细胞的分裂和增殖(Ko et al.2008， Process Biochemistry 43：423-430)。FIP-fve能够激活和诱导人外周血淋巴细胞和 T淋巴细胞分泌白介素IL-2、干扰素IFN-γ、肿瘤坏死因子TNF-α等细胞因子以 及粘附因子ICAM-1，后者可促进不同的白细胞与靶细胞牢固结合，在上皮细胞 发生炎症的调控、免疫反应和组织修复中起重要作用。在非特异性免疫方面， FIP-fve还可以提高TNF-β和一氧化氮的产量，显著地提高腹腔细胞对患癌细胞 的杀灭能力，提高罹患小鼠血清中特异性抗体的浓度。还能有效抑制鼠类系统 性过敏毒素反应，鼠足垫水肿反应。研究表明FIP-fve对食物过敏和过敏性呼吸 道类疾病也有较好的治疗效果，可以对抗器官移植后的排异现象以及抑制对自 体免疫所引起的糖尿病，通过减少IL-5α受体以及凋亡信号蛋白表达诱导嗜酸性 粒细胞凋亡而有效抑制炎症和过敏反应。因此，FIP-fve是一种潜在的非常有效 的免疫调节类药用蛋白。

由台湾发明人申请的专利“真菌免疫调节蛋白之用途”(中国 200610127042.7)公开了天然和重组的灵芝免疫调节蛋白的免疫调节和抗肿瘤作 用。其中提到天然金针菇免疫调节蛋白对降低糖尿病患者血糖的作用。由台湾 发明人申请的专利“用敏感贴剂对过敏性鼻炎进行鼻腔局部免疫治疗”(Local nasal immunotherapy with allergen strip for allergic rhinitis；美国US Patent 20040071718)阐述了天然金针菇免疫调节蛋白可以治疗过敏性鼻炎。由新加坡 发明人申请的专利“分子”(Molecule；美国20060275312USPTO)公开了天然金针 菇免疫调节蛋白的晶体结构，并以天然和细菌重组的融合蛋白为例阐述了金针 菇免疫调节蛋白在治疗和诊断免疫疾病方面的用途。