[发明专利]一种海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋卤代酸脱卤微生物，具体地说是海洋中有氧条件下催化卤代酸脱卤微生物的分离筛选的新方法。

背景技术

卤化物被广泛地用来生产杀虫剂，除草剂，工业用溶剂和脱脂剂，其中卤代酸尤其手性纯产品有着巨大的应用前景。同时由于大量使用，现在有机卤化物已成为公认的“危险性”有毒污染物，据文献报导卤代酸广泛存在于自然环境之中，尤其是水环境中。研究脱卤酸脱卤酶一方面可以生产手性有机中间体，另一方面有重大环境应用价值可以用于污染水源的脱卤处理，工厂的有机废水处理，用于环境修复等方面。传统的卤代酸分离纯化方法都是以土壤为分离源，通过检测微生物脱卤产生的卤族元素来筛选。由于海洋中很多微生物，海洋藻类，海洋动物可产生多种卤化物，同时由于大量的工业和生活废水排放入海，使得海洋中有机卤化物的含量和种类都非常丰富。海洋相对于陆地是脱卤微生物的更好分离源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便易行、快速有效的海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选新方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

首先选取海洋中卤化物较丰富的海区(如污染严重的河口区)或经检验含有丰富卤化物的海区中微生物多样性高的海洋样品为分离源；通过特殊设计的卤代酸单一碳源液体培养富集培养样品中的脱卤微生物，通过检测培养基颜色变化，快速获得大量目的微生物；以显色平板对富集后的大量微生物进行筛选，通过颜色变化很容易挑出活性较好的目的菌株；最后对初筛得到的目的菌株进行液体培养，用HPLC的方法对菌株脱卤能力进行检测，以比色法检测菌液OD600值来比较菌株生长能力，最终得到生长性状良好降解能力较强的脱卤菌株。目标菌株可以在有氧条件下催化卤代物进行脱卤反应，其反应式为：

RCLOOH+H₂O→ROHCOOH+HCL

一种海洋卤代酸脱卤微生物的分离筛选方法，以海洋样品为菌株分离源，以卤代酸为单一碳源进行富集培养，经过显色平板和液体培养筛选得到具有卤代酸脱卤能力的菌株，具体工艺步骤如下：

1)取海洋样品，称重，样品于装有无菌海水的烧杯中洗涤3～5次，洗去样品表面附着的微生物和其它杂质；

2)将样品放入灭菌后的研钵中，加入其5-10倍重量体积比(5-10mL无菌海水/g样品)的无菌海水，研磨至均匀的浆液；取浆液1-10mL加入100mL卤代酸液体培养基中，在三角烧瓶中20～40℃，150～250转/分摇瓶培养；观察培养液颜色变化由蓝色变为橙红色时，取1-10mL菌液加入新的卤代酸液体培养基中，继续摇瓶培养；

3)观察菌液再次变为橙红色时取0.5mL，加入装有4.5mL无菌海水的试管中涡旋混匀，取混匀后的菌液200ul备用；

再取上述混匀后的菌液0.5mL，加入装有4.5mL无菌海水的试管中涡旋混匀，取混匀后的菌液200ul备用；

重复上述操作过程6-9次，使最终菌液的浓度稀释到原培养后浓度的10^-6～10^-9；

4)分别取上述稀释操作中各步的备用菌液50-200ul涂卤代酸显色培养基平板，每个备用菌液涂5～10个平板；25～35℃培养箱中倒置培养，观察菌株生长与情况，当平板上出现明显的橙红色菌株后挑取深红色的菌落在卤代酸显色平板上划线；划线后的平板再于25～35℃培养箱中倒置培养3～5天，挑取深红色的单菌落继续在显色平板上划线培养，重复这一过程3～5次；

5)挑选深红色的菌落接种2216E平板，培养2～3天后挑取单菌落接种2216E液体培养基在试管中25～35℃，150～250转/分培养24～48小时，观察培养液出现明显浑浊后取菌液加入装有体积浓度15-20％甘油水溶液的冻存管中颠倒混匀后-70℃放置保存备用；

6)在菌株生长的2216E平板上，取1环菌体接种到装有100～200mL卤代酸液体培养基的三角烧瓶中，培养基中卤代酸浓度10～30mM，25～35℃，150～250转/分摇瓶培养；3天后分光光度计检测菌液在600nM波长检测光下吸光值(OD600)，HPLC检测菌液中残留卤代酸量，OD600值大于等于1，卤代酸降解率(残留卤代酸浓度/卤代酸初始浓度)大于等于50％的菌株即为高活力卤代酸脱卤菌株。

所述海洋样品为海洋生物、海洋植物、海底沉积物、海泥或海水中的未滤过物，海水中的未滤过物是指将海水样品用0.22uM膜抽滤，膜表面残留的未滤过物。