[发明专利]益生菌与病毒偶联生产药物的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种动物用药物的生产方法，尤其是一种用益生菌与病毒偶联 生产可同时具有抗菌及免疫调节作用、同时治疗病毒病和细菌病药物的方法。

背景技术：

目前，对于动物体内病毒和细菌混合感染通常都是采用分别用药且大多为 肌肉注射给药方式。如对于鸡的新城疫病毒和大肠杆菌的混合感染，需要分别 肌肉注射新城疫病毒高免血清及抗菌素，不仅成本高及给药频率高，所产生的 应激反应大，而且治愈率最高仅能达到65％，鸡患病后的死亡率高。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用益生菌与 病毒偶联生产可同时具有抗菌及免疫调节作用、同时治疗病毒病和细菌病药物 的方法。

本发明的技术解决方案是：一种益生菌与病毒偶联生产药物的方法，其特 征在于按以下步骤进行：

a.取益生菌蛋白；

b.将益生菌蛋白与病毒蛋白按质量比为4～6∶1混合并加入与益生菌蛋白 及病毒蛋白等质量的EDC偶联剂偶联；

c.将所得的偶联物制成免疫原备用；

d.用免疫原对个体较本原病毒宿主大的异种动物免疫二次；

e.二次免疫后，每隔一周采集被免疫的异种动物血一次，分离血清，以HI 试验检测抗此病毒和益生菌的抗体效价，待抗体效价达到8Lg2时，从免疫的 异种动物静脉采血并分离血清备用；

f.将e步骤所得血清按每毫升血清与含20亿的益生菌悬液混合，37℃作 用1小时后，4℃保存。

所述a步骤是取益生菌培养液离心、去上清，再用与益生菌培养液同体积 的已灭菌生理盐水加入离心桶中，将菌泥吹起制成菌悬液后经三次洗涤离心后 去上清、取沉淀。

所述d步骤免疫二次的用量分别为第一次0.5ml/kg、第二次0.7ml/kg。

本发明是利用蛋白质偶联技术，将益生菌菌体蛋白与病毒蛋白按比例偶联 在一起，通过免疫异种动物，获得了抗此益生菌和病毒的抗体，其产量是本原 病毒宿主的300～500倍。所获得的抗体与益生菌按比例混合作用后即能达到同 时治疗病毒和细菌混合感染且能通过口服给药，治愈率达到了80％以上，降低 了患病动物的死亡率，同时也降低了用药成本，减少了对动物频繁接种、多次 用药而产生的应激反应。

具体实施方式：

实施例1：

a.在无菌超净工作台里挑取已纯化鸡源粪链球菌单菌落(V球)接种已灭 菌的MRS液体培养基中，37℃培养24h，培养结束后取500ml菌液(V球) 离心(3000r/min)，结束后弃掉上清。再用500ml已灭菌生理盐水加入离心桶 中，将菌泥吹起制成菌悬液后经100ml的pH值8.0的PBS缓冲液三次洗涤离 心(3000r/min)后去上清留沉淀，称取沉淀湿重，即鸡源粪链球菌蛋白质量。 以分光光度计法测新城疫病毒的蛋白含量，将鸡源粪链球菌蛋白与新城疫病毒 蛋白按质量比5∶1比例混合，再加入鸡源粪链球菌蛋白与新城疫病毒蛋白总 量等质量的EDC，缓慢搅拌避光反应过夜。

b.次日将偶联物离心(10000r/min，离心5min)，弃上清以去掉未偶联上 的病毒，留沉淀并加入100ml的生理盐水溶解偶联物，并保存在4℃作为免疫 原备用。

c.用制备好的免疫原免疫6个月左右的山羊，首免采用穴位和肌肉分点注 射的方式，每只羊按免疫原0.5ml/kg免疫，二免在首免后15天进行，每只羊 按免疫原0.7ml/kg免疫，二免后每隔一周采血一次，分离血清，以HI试验检 测新城疫抗体效价，待新城疫抗体效价达到8Lg2时，从羊颈静脉采血并分离 血清备用。

d.将c步骤所得血清与鸡源粪链球菌按每毫升血清与含20亿的粪链球菌 菌悬液混合后37℃作用1小时即可，4℃保存备用。

实验例1：

取100只SPF鸡，分别采用肌肉注射和口服途径使其新城疫病毒和大肠杆 菌混合感染，按50只为一组，分为两组分别按现有技术以及本发明实施例1 给药，效果如表1。

表1

结果：用实施例1的制剂作为新城疫病毒和大肠杆菌混合感染的治疗用药 作用于患病鸡体，治愈率为82％。

实施例2：