[发明专利]人补体片段C5a基因及其克隆、重组蛋白表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及人补体片段C5a在大肠杆菌表达系统中的克隆和表达，以及表达产物的纯化和生物活性。属于分子生物学技术领域。

背景技术

C5是形成膜攻击复合体(MAC)的第一个补体分子，分子量190kDa，由α和β两条多肽链组成，两条多肽链之间以二硫键相连接，其中α链为115kDa，β链为75kDa。靠近N端的第74-75位精氨酸一亮氨酸键为C5转化酶作用的部位。在C5转化酶的作用下，C5的α链N末端裂解出一个分子量为11kDa的小片段C5a进入液相中，其余部分为110kDa的大片段C5b，仍结合在细胞膜表面。

C5a具有广泛的生物学活性。概括起来有以下几方面：(1)过敏毒素作用：C5a是具有过敏毒素作用的补体裂解片段中作用最强的介质，较C3a强20倍，较C4a强2500倍。此外，C5a还可不依赖于肥大细胞释放组胺，即通过直接作用于血管内皮细胞而增加血管的通透性。(2)趋化作用：高浓度的C5a是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的趋化剂，可刺激这些细胞沿着浓度定向移动。值得注意的是，被血清羧肽酶N裂解掉羧基末端的精氨酸而形成的去精C5a虽丧失了使肥大细胞分泌组胺的能力，但仍具有较强的趋化活性，是补体活化后产生趋化作用的主要因素。(3)促代谢作用：高浓度的C5a可刺激中性粒细胞和单核细胞的氧化代谢，提高其cGMP的水平，有利于促进溶酶体与细胞膜的融合，释放溶酶体酶。此外，C5a还可刺激中性粒细胞粘附及增强其产生超氧化物。(4)免疫调节作用：近年体外研究表明，C5a对免疫应答有明显增强作用，如可诱导单核细胞分泌IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等细胞因子，促进抗原及同种异体抗原诱导的T细胞增殖及B细胞产生抗体等。

C5a为重要的前炎性介质，起炎症启动和放大作用，有很多促炎作用，如引起血管舒张、血管通透性增加，对中性粒细胞有强烈的趋化作用，并能促使中性粒细胞脱颗粒和呼吸爆发，以及协同其它介质进一步促进白细胞的活化，因而C5a在许多炎性疾病的病理发生过程中起重要作用。

发明内容

本发明根据Genbank中公布的人C5a的基因序列并结合大肠杆菌偏爱密码子设计并合成一组引物，通过重叠PCR的方法获得C5a的DNA片段，在DNA片段的5’端和3’端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，将其克隆于pET32a载体中，并将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过对诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度的摸索和优化，Trx-C5a融合蛋白以胞内可溶性蛋白的形式表达。

本发明通过Ni2+亲和层析的方法从表达产物的超声裂解液中纯化Trx-C5a融合蛋白，纯化的Trx-C5a融合蛋白通过肠激酶切割掉Trx标签，酶切产物经过进一步纯化，去除Trx标签蛋白和肠激酶，最终获得了高纯度的C5a蛋白。

本发明用Transwell实验验证该C5a蛋白对人中性粒的趋化作用。分离人外周血中性粒细胞，将不同浓度的C5a蛋白加入24孔细胞培养板的孔中，将Transwell小室(预先用3.0μM微孔纤维素滤膜包被)安置到板孔中，并向Transwell小室中分别加入分离出的人外周血中性粒细胞(1×10⁶/孔)，37℃水浴30mim，保持24孔板静止勿振动，将细胞培养插件取出，吸出细胞悬液，用流式细胞仪检测中性粒细胞数。C5a蛋白加入与否以及加入浓度的不同，会使通过细胞培养插件的中性粒细胞数有所区别，这种区别可以用相同时间内通过流式细胞仪的中性粒细胞数反映出来。Transwell实验表明本发明获得的C5a蛋白对人中性粒细胞具有趋化作用。

本发明用硝基四氮唑蓝还原法验证了该C5a蛋白引起人中性粒细胞呼吸爆发的活性。C5a蛋白刺激中性粒细胞产生呼吸爆发，形成H₂O₂、OH^-和¹O2可使无色的硝基四氮唑蓝还原呈蓝黑色，以分光光度计测570～610nm的光密度值，作为呼吸爆发产生超氧阴离子的指标。分离人外周血中性粒细胞，将中性粒细胞悬液、不同浓度的C5a蛋白和硝基四氮唑蓝混匀，37℃水浴振摇孵育30min，用1mmol/L的HCl终止反应，离心去除上清，用DMSO溶解细胞沉淀，以酶标仪检测572nm处的光密度值。硝基四氮唑蓝还原实验表明本发明获得的C5a蛋白能引起人中性粒细胞呼吸爆发。