[发明专利]小轴海绵不同类型细胞和细胞团的分离制备方法

权利要求书

1.小轴海绵不同类型细胞和细胞团的分离制备方法，其特征在于：

可按如下步骤操作，

(1)小球细胞特异聚集：取健康洁净的小轴海绵组织，切成约0.5-2mm厚的片状，在含高浓度的乙二胺四乙酸二钠EDTA的无钙镁海水CMFSW中用镊子轻轻挤压，得到的混合细胞液经300-350目筛绢过滤后于平皿中静置，待小球细胞特异聚集成团块后，水平振荡平皿使聚集体重悬，待其自然沉降后吸取上清细胞悬液，为细胞悬液A；并添加含EDTA的CMFSW，反复进行水平振荡平皿、吸取上清细胞悬液和添加含EDTA的CMFSW的操作，平皿中剩余的细胞聚集体即为小球细胞富集体，对该聚集体用无菌天然海水进行培养，得到I型细胞团；

(2)低速离心：将细胞悬液A离心，离心力30-40g，细胞沉淀用无钙镁海水重悬，得到细胞悬液，为细胞悬液B，接种至无菌天然海水中培养得到II型细胞团；

(3)速率沉降：将细胞悬液B，经蔗糖或泛影葡胺介质速率沉降后收集中间细胞条带，离心后重悬得到细胞悬液，为细胞悬液C；

(4)高速离心：将细胞悬液A经30-40g离心后的上清细胞悬液再次离心，离心力90-110g，细胞沉淀用无钙镁海水重悬，得到的细胞悬液，为细胞悬液D)接种至无菌天然海水中培养，得到III型细胞团；

(5)密度梯度离心：细胞悬液C，经密度梯度离心可分别得到灰细胞和原细胞的富集体，细胞悬液D经密度梯度离心，得到领细胞的富集体。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于：所用无钙镁海水(CMFSW)的组分为氯化钠(NaCl)30-35g/L，无水硫酸钠(Na₂SO₄)0.99g/L，氯化钾(KCl)0.75g/L，三羟甲基氨基甲烷(Tris-Base)2.42g/L，余量为水；含乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的无钙镁海水中，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的浓度为15-30μM。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中混合细胞在平皿里含EDTA的CMFSW中的静置时间为20-40分钟。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中水平振荡平皿后，等待聚集体沉降的时间为20-30秒。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中水平振荡平皿、吸取上清细胞悬液和添加含EDTA的CMFSW的操作，制备I型细胞团时需重复3-4次，富集小球细胞时需重复6-7次。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中低速离心的条件为30-40g，3-5min。

7.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所用蔗糖介质为无钙镁海水配制，浓度10％-12％(g/ml)，泛影葡胺介质为76％的泛影葡胺原液以无钙镁海水稀释成为体积浓度7.5％-10％溶液，下层介质与上层细胞液之间的体积比为2∶1-4∶1，沉降时间为10-20min。

8.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中高速离心条件为90-110g，3-5min。

9.按权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中细胞悬液C的密度梯度离心条件上层为体积浓度14％-16％泛影葡胺，下层为体积浓度30％-32％的泛影葡胺，40g，8-10min离心；细胞悬液D的密度梯度离心条件上层为体积浓度10％-12％泛影葡胺，下层为体积浓度20％-22％的泛影葡胺，90g，8-10min离心。