[发明专利]一种提高适冷蛋白酶热稳定性的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及适冷蛋白酶的稳定化技术，属于海洋生物技术领域。

(二)背景技术

适冷酶主要由生活在高山、极地、深海等永久性低温环境中的适冷微生物或变温动物合成或分泌的，其主要特征是在低温下保持较高的催化活性，在0～30℃范围内，适冷酶比相应的中温酶具有更高的催化效率，因此，适冷酶具有广泛的应用前景。

但是，适冷酶也有明显的不足之处，研究表明，适冷酶在低温下的高催化效率，伴随着其热稳定性的降低，因此，即使在中等温度下，适冷酶也很容易失活，给酶的保存带来很大的困难，从而大大限制了适冷酶的应用。

因此，提高适冷酶的稳定性是突破适冷酶应用瓶颈的关键，目前大多采用蛋白质定点突变、定向进化或随即突变筛选等技术策略，并且有成功的例子，但是上述技术策略往往导致在提高酶的稳定性的同时，酶的适冷性也随之降低。加之这些技术大多适用于实验室规模，并且费用较大，因此，很难大规模推广应用。

化学修饰也是用于提高适冷酶热稳定性的方法之一，并且已经成功应用于碱性磷酸酶、适冷脂酶B，适冷胰蛋白酶的热稳定性改造。但是，由于化学修饰的位点专一性较差，因此，因此，很难达到均一。

(三)发明内容

本发明针对适冷蛋白酶结构柔性较强热稳定性不高的技术难题，提供一种提高适冷蛋白酶热稳定性的方法。

术语说明：

1.适冷蛋白酶：在0℃仍能保持较高的催化效率，可水解蛋白酶，释放出具有鲜味的氨基酸。在较高温度下酶活性显著降低、结构不稳定。

2.中温蛋白酶：相对于适冷蛋白酶而言，在0℃下催化效率较低，最适酶活温度为40-60℃。

3.Tris—HCl缓冲液：是一种本领域常用缓冲液。配制方法：称量121.14g Tris置于1L烧杯中，然后加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，用浓HCl调节pH值至7.5，最后将溶液定容至1L，这样配制的是1M的Tris—HCl缓冲液，用时稀释。

4.TMAO：氧化三甲胺，白色晶体，是一种天然的渗透调节剂，现主要用作饲料添加剂。

5.Eppendorf管：1.5mL的小离心管。

本发明的提高适冷蛋白酶的热稳定性的方法，步骤如下：

(1)将适冷蛋白酶用20mM、pH7.5的Tris—HCl缓冲液配制成1mg/ml的适冷蛋白酶母液，

(2)将氧化三甲胺(TMAO)配制摩尔浓度为5M溶液，

(3)将步骤(1)的适冷蛋白酶母液加入到步骤(2)的氧化三甲胺(TMAO)溶液中，再添加20mM、pH7.5的Tris—HCl缓冲液至蛋白酶的终浓度为0.20mg/ml，氧化三甲胺的终浓度为0.25M—1M。

本发明所述的适冷蛋白酶是具有明显的适冷特性的蛋白酶，现有技术报道的适冷蛋白酶均可用本发明的方法提高其热稳定性。例如，但不限于：(1)按专利CN1336433(01127405.0)“适冷风味蛋白酶的制备方法及应用”制得的适冷蛋白酶；(2)适冷菌Pseudomonas sp.SM9915分泌的适冷蛋白酶，参见陈秀兰等，海洋与湖沼，2003，34(2)，155-160)；(3)北极耐冷假交替单胞菌BSw20308及BSw20353分泌的适冷蛋白酶，参见曾胤新等，高技术通讯，2007，17(5)，535—539。

本发明的方法处理后的产品首先用CD光谱、荧光光谱检测TMAO的加入是否对其结构有明显影响，经测定发现加入不同浓度的TMAO的适冷蛋白酶其光谱呈现了很好的吻合性(如图1、图2)，说明TMAO不会影响适冷蛋白酶的结构，然后分别检测它的酶活性，酶学动力学参数，热力学参数，热稳定性，以及变构温度(如图3、图4)。

测定样品的准备：在0.5ml的Eppendorf管中分别加入0—400μl TMAO浓溶液，然后在每个管中加入100μl的蛋白酶母液，所有管最后加入蛋白酶所对应的缓冲液补足到500μl。蛋白酶的终浓度为0.20mg/ml，TMAO的终浓度为OM—1M。配好的待测样品混匀，在4℃分别放置120分钟，然后进行光谱测定和酶学测定。具体方法如下：

1.适冷酶活性稳定性检测，酶活测定方法采用以酪蛋白为底物的福林酚法。