[发明专利]乳腺癌细胞C35基因siRNA表达载体的构建以及抗肿瘤治疗应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程领域，具体地说是乳腺癌细胞C35基因siRNA序列设计、表达载体的构建及其中抗肿瘤治疗中的研究和应用。 

背景技术

传统的肿瘤治疗方法有化疗、手术、放疗和内分泌治疗，给患者带来了痛苦，不能从根本上解决抗肿瘤问题。随着对肿瘤细胞生长、增殖、凋亡的分子机制研究的深入，现代肿瘤的治疗已进入生物治疗时代，靶向性治疗肿瘤已成为可能。近年来基因阻断技术在基因功能研究中有很大进展，临床治疗研究也显示了良好的前景，为我们设计抗肿瘤治疗方案提供了可借鉴的技术手段。 

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是最近几年来发现和发展起来的新兴基因阻断技术。自RNAi现象报道以来，科学家对其作用机制进行了大量研究，目前认为涉及包括RnaseIII内切酶Dicer等多步骤过程，最终产生有活性的21～23nt小干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)，介导与其互补同源mRNA序列的特异性见解。其作用具有高效、特异的特点，比反义寡核苷酸抑制目的基因的效果更好。从目前的研究报道来看，RNAi技术主要用于基因功能和抗肿瘤研究，具有良好的效果。 

国内外有关RNAi抗肿瘤的相关报道有很多，但是运用RNAi阻断技术设计针对C35基因不同编码区的siRNA序列，进一步构建C35siRNA表达载体，至今未见国内外报道。同时在体外实验转染细胞后运用RT-PCR技术检测抑制后基因表达的情况；此外在体外转染实验中细胞模型中运用Western Blot对C35siRNA特异抑制C35蛋白进行了研究，并运用MTT、TUNEL和AnnexinV/PI流式细胞分析法实验证实C35siRNA具有较强抑制乳腺癌细胞生长的作用，亦未见报道。因此，本技术的理论意义和实际意义都将是十分重大的。 

发明内容

本发明的目的是为了设计针对C35不同靶基因区siRNA序列，并以pTZU6+1为表达载体，构建一系列siRNA重组体，在体外实验中系统研究其抑制C35表达 的作用，为进一步在体内抗肿瘤打下了良好的实验基础。 

本发明包括两对C35siRNA序列的设计。 

本发明包括独特的茎环结构C35siRNA的设计，即正向和方向重复19nt单链DNA通过中间折叠结构的间隔，同时设计在一条核苷酸链上。 

本发明包括C35siRNA表达载体pSIRNAC35-1和pSIRNAC35-2的构建。 

本发明包括在体外实验转染细胞后运用RT-PCR技术检测抑制后基因表达的情况。 

本发明包括体外转染实验中细胞模型中运用Western Blot对C35siRNA特异抑制C35蛋白进行了研究。 

本发明包括体外转染试验中运用MTT、TUNEL和Annexin V/PI流式细胞分析法技术对乳腺癌细胞的增殖和凋亡进行了研究。 

本发明所构建的C35siRNA表达载体经酶切鉴定、序列测定表明构建成功，在体外转染的细胞模型中，通过RT-PCR和Western Blot实验均证实C35蛋白产物的表达受到明显抑制，通过MTT、TUNEL和AnnexinV/PI流式细胞分析法实验证实乳腺癌细胞的生长受到明显抑制，肿瘤细胞发生凋亡，能较为明显地证实C35siRNA具有抑制乳腺癌细胞中C35基因的表达和肿瘤细胞的生长的作用。 

本发明所述的C35siRNA表达载体可作为一种新型抗肿瘤基因治疗药物，运用到临床治疗中。可以将所述的C35siRNA作为基因药物直接进行裸DNA注射，导入机体的肿瘤组织内；或利用金包被DNA枪轰击法，将构建好的表达载体质粒DNA包被在金微粒子表而，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入肿瘤组织细胞；或作为主要活性组分，添加适用的药用辅料，制备抗肿瘤药物。 

本发明提供了两种靶向C35基因序列的siRNA表达载体，在构建针对C35基因的siRNA表达载体时，根据siRNA的设计原则，分别选择C35蛋白编码区259nt-278nt，编码区282nt-300nt的核苷酸序列，设计相应的siRNA；用BLAST软件进行同源分析证实为C35高度保守序列后，化学合成单链寡核苷酸；体外经退火形成双链DNA，与真核表达载体pTZU6+1连接，酶切鉴定和序列测定分析表明成功构建了两种靶向C35基因序列的siRNA表达载体。 

本发明人所设计的两对C35siRNA序列为： 

(1)序列：C35编码区259nt-278nt位核苷酸