[发明专利]半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法

说明书

技术领域

本发明属于半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)DNA分子遗传标记技术，涉及一 种抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是一种暖温性 近海大型底层鱼类，终年生活栖息在我国近海海区，已经成为我国最具有发展潜力的海 水养殖新品种之一。半滑舌鳎是一种生长快速、抗病力强、肉味鲜美的优良海水养殖鱼 类。半滑舌鳎的这种优良性状是有其遗传学基础的。探索半滑舌鳎生长快和抗病力强的 分子基础，筛选和克隆出与抗病性状相关的特殊功能基因和标记，开发其在海水鱼类抗 病育种与防病、治病中的应用潜力，对于海水鱼类养殖业具有重要的现实意义及应用价 值。cDNA-AFLP是一种应用于基因组DNA的选择性扩增限制性片段即AFLP(Amplified fragment length polymorphi sm)的基础上发明出来的用于RNA指纹分析的方法。它将 RT-PCR和AFLP结合起来，由于在PCR中使用较高的退火温度和应用特定引物对包含信 息较多的内部特异片段进行选择性扩增，增加了反应条件的严谨度。利用cDNA-AFLP技 术分离、克隆半滑舌鳎抗病相关片段，为半滑舌鳎抗病基因的克隆提供序列信息，进而 培育出天然抗病力增强的海水鱼类新品种，或生产出抗病的功能基因药物，在水产养殖 中推广应用就显得尤为重要和迫切。

发明内容：

本发明的目的是为了克隆出半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段，分析其序列， 建立半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法，为半滑舌鳎抗病基因的克隆提 供序列信息支持。

本发明其技术内容如下：

包括两个方面：

一、注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种半滑舌鳎的cDNA-AFLP差异显示。

二、半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的克隆与序列分析。

一、注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种半滑舌鳎cDNA-AFLP差异显示。

半滑舌鳎腹腔注射鳗弧菌，注射鳗弧菌可以启动或增强抗病相关基因的表达。以 未经鳗弧菌注射的半滑舌鳎作对照，提取免疫器官脾藏组织中的总RNA，并反转录成 cDNA。以cDNA作为模板进行注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种鱼的AFLP差异显示，获得 差异显示的片段。

二、半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的克隆与序列分析：它的技术内容包 括：1)半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收；2)抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片 段的克隆；3)抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的序列分析：

1)、抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的回收：

选取能扩增出496bp抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩 增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下含有496bp抗鳗弧菌特异DNA 条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。

2)、cDNA-AFLP片段的克隆：

将回收的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段，克隆到pMD18-T载体中，连接和转化后， 采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预 期长度的样品可以视为阳性克隆。3)、序列分析：选取阳性克隆，测序后进行序列分析。 将来自6个阳性克隆的抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的核苷酸序列，进行多序列比对， 其同源性为99.21％，表明各个个体得到的条带是同一个序列。共有序列同源性比对和 相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。

具体实施方式：

采用分子克隆技术，克隆出半滑舌鳎抗鳗弧菌特异的cDNA-AFLP片段，建立半滑舌 鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取技术，进而获取半滑舌鳎抗病相关基因，具有重 要的现实意义。下面通过‘半滑舌鳎抗鳗弧菌特异cDNA-AFLP片段的获取方法’的实施 例，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明：

一、注射鳗弧菌和未注射鳗弧菌两种半滑舌鳎的cDNA-AFLP差异显示。

1、鳗弧菌注射

采用腹腔注射法对半滑舌鳎注射0.5mL 1OD的鳗弧菌悬液，注射鳗弧菌可以启动或 增强抗病相关基因的表达。以未经鳗弧菌注射的半滑舌鳎作对照。

2、RNA的提取