[发明专利]人转录因子HMBOX1基因的应用

说明书

技术领域

本发明涉及人转录因子HMBOX1基因的应用，特别是HMBOX1基因过表达后对自然杀伤细胞调控的应用，属于功能基因组学技术领域。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是三大类淋巴样细胞之一，属于天然免疫系统，一直被誉为是机体抗癌、抗病毒的前哨，而且活化的NK细胞还可以通过分泌细胞因子等方式，来调节其他细胞的特异性和非特异性免疫反应，因此又被称为连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。NK细胞的活化与否，以及其后续的功能活性，是由其表达的活化性受体和抑制性受体所决定，例如最重要的NKG2家族，目前对NK细胞受体的功能研究较多，但是至今有关NK细胞受体表达调控的机制尚未得到阐明。

HMBOX1(homeobox containing 1)基因位于人染色体8p12.3和8p21.1的交界处，全长1263bp，是homeobox家族成员之一。由其经典的Homeobox DNA结合结构域和报告基因实验初步预测为转录抑制因子。该家族其他成员在NK细胞的发育成熟过程中起关键作用。但HMBOX1的具体功能尚未见报道，属于新的功能未知蛋白。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种人转录因子HMBOX1基因及其编码蛋白的应用。并以NK细胞的功能实验为基础，阐明人转录因子HMBOX1在NK细胞中的功能。由于其所在蛋白家族的重要性，对HMBOX1具体功能的研究，不仅揭示这个新基因的功能，而且为进一步了解NK细胞发育和功能调节过程奠定基础。

发明概述

本发明利用分子克隆方法构建HMBOX1基因真核过表达载体。通过电转方法将质粒导入NK细胞，经G418筛选建立稳定的NK-HMBOX1过表达细胞株。应用MTT法、流式细胞术、Real-time PCR技术，分别对NK细胞的增殖、杀伤、脱颗粒能力以及活化/抑制性受体、细胞因子和杀伤颗粒表达水平进行检测。研究HMBOX1对NK细胞的功能调节作用。

发明详述

人转录因子HMBOX1基因在调控自然杀伤(NK)细胞功能方面的应用，通过如下步骤构建过表达载体，并使过表达载体表达来实现：

(1)HMBOX1基因cDNA克隆及过表达载体构建：

提取NK-92细胞的RNA，逆转录成cDNA，扩增HMBOX1 cDNA全长1263bp，设计引物，引物设计时根据pcDNA3.1-myc/his(-)载体说明书，起始密码子前加KOZAK序列增强蛋白表达，终止密码子由TAA点突变为TGA，使后续的myc和his标签能正常表达。PCR扩增，PCR产物凝胶回收后，连接入T载体，经测序证明序列完全正确；然后用限制性内切酶BamHI和EcoRI将全长片段切下，凝胶回收后链接到pcDNA3.1-myc/his(-)载体上，经测序验证，即得HMBOX1基因过表达载体pcDNA3.1-HMBOX1，序列如SEQ ID NO.1所示；(图1)

(2)Western blot鉴定HMBOX1表达载体在HEK293中的表达：

将步骤(1)制得HMBOX1基因过表达载体pcDNA3.1-HMBOX1通过脂质体Liptofectamin2000转染入HEK293细胞中，24小时后提取细胞总蛋白，并做SDS-PAGE和Western blot，用抗标签蛋白myc抗体检测HMBOX1蛋白的表达。(图2)

上述步骤(1)中的引物序列为：5’CGGCTAGCGCACCATGGCGATGCTTAGTTCCTTTCCAGTG 3’和5’CCGAAGCTTGAGTCATCATCCAGGGCCT 3’。

上述步骤(1)中的PCR扩增，反应条件如下：95℃，5分钟，1个循环；94℃，1分钟，60℃，1分钟，72℃，90秒，35个循环；72℃，10分钟，1个循环。

经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后不影响NK细胞的增殖(图4)。

经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后，NK细胞对靶细胞HepG2和K562的杀伤能力显著下降，NK细胞的脱颗粒能力也明显下降(图5、6)。

经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后，NK细胞表面活化受体NKG2D表达下降，并且NKG2D和其接头蛋白DAP10的mRNA水平也有下降。但NK细胞表面表达的其他杀伤相关受体NKG2A、CD54、FasL、NKp46、TRAIL没有明显变化(图7、8、9)。

经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后，NK细胞表达细胞因子TNF-α和IFNγ的mRNA水平下降，IFNγ的蛋白水平下降显著(图10、11)。