[发明专利]一株用于好氧发酵的大肠杆菌工程菌株

说明书

技术领域

本发明涉及一株用于好氧发酵的大肠杆菌工程菌株E.coli Q10(CCTCC M 209113)，属于基因工程和微生物发酵领域。 

背景技术

大肠杆菌作为一种模式生物，由于其遗传背景清楚、操作技术成熟等特点，已经广泛应用于遗传、代谢工程等诸多领域。诸多外源性蛋白已经成功在大肠杆菌中表达并生产。通过基因工程改造大肠杆菌，诸如琥珀酸发酵、聚羟基脂肪酸发酵、谷氨酸发酵及乳酸发酵等途径已成功构建。 

大肠杆菌虽然应用广泛，但存在许多缺点。如乙酸盐的分泌就是一个利用大肠杆菌发酵中常常面临的问题。当外界环境中存在高浓度的葡萄糖等碳源时，大肠杆菌由于代谢不平衡而分泌大量的乙酸盐。乙酸盐的分泌不仅造成了碳源的浪费，同时乙酸盐对菌体的生长有抑制作用，因而乙酸盐的分泌不利用菌体的正常生长和发酵的进行。 

大肠杆菌中存在两条主要的乙酸生成途径。一条是丙酮酸通过PoxB(丙酮酸氧化酶)的催化生成乙酸；另一条途径则是乙酰-CoA通过Pta(磷酸转乙酰基酶)和ackA(乙酸激酶)生成乙酸，同时生成ATP。上述两条途径作用时间不同，大肠杆菌在时空上通过调节相关酶类来调节乙酸的生成速率。PoxB途径主要在大肠杆菌进入稳定期后发挥作用；而Pta-ackA途径则主要是大肠杆菌在对数生长期时发挥作用。 

当前有两种方法已经应用于减少乙酸盐的分泌。一种是对发酵工艺的优化，即通过控制葡萄糖等碳源的浓度来减少乙酸的分泌。虽然该方法可以减少乙酸的生成，但是延长了发酵周期。而另一种方法则是通过代谢工程手段，即阻断乙酸生成分泌的直接途径，减少乙酸的生成。然而过去的相关研究文献只是针对个别乙酸相关基因进行单独研究。而在大肠杆菌代谢途径及其调控方式的基础上构建同时缺失ptsG、poxB和pta基因的工程菌株的研究和专利还未见报道。 

发明内容

针对大肠杆菌发酵过程中所存在的乙酸盐分泌问题，本发明目的是通过基因工程，利用基因敲除构建一株应用于好氧发酵的大肠杆菌工程菌株。同时，利用该工程菌株积累聚羟基脂肪酸酯(PHA)，本发明以PHA家族中的代表聚-β-羟基丁酸酯(PHB)为例来阐述该工程菌株的应用。 

本发明所述用于好氧发酵的大肠杆菌工程菌株，其特征在于：该菌株名为埃希氏大肠杆菌Q10，即为大肠杆菌Q10(Escherichia coli Q10)；菌株已于2009年5月27日保藏在“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号为CCTCC M 209113。 

上述大肠杆菌工程菌株Q10外形呈杆状，大小为0.4～0.6微米×1～3微米，无芽胞。有普通菌毛与性菌毛，属于革兰氏阴性杆菌。此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。菌株的基因型为MG1655ΔptsGΔpoxBΔpta::Cm。 

上述大肠杆菌工程菌株的出发菌株是大肠杆菌MG1655、DH5a、JM109、W3110、XL1-Blue中的一种，其中优选菌株为大肠杆菌MG1655。所述MG1655、JM109和W3110购买于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；DH5a与X11-blue购买于DSMZ(德国微生物保藏中心)。真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)购买于CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)。 

上述大肠杆菌工程菌株是通过敲除ptsG、poxB及pta基因而构建，其基因型可以由MG1655ΔptsG、MG1655ΔpoxB、MG1655Δpta、MG1655ΔptsGΔpoxB、MG1655ΔpoxBΔpta或MG1655ΔptsGΔpta基因型进一步改造获得。 

上述大肠杆菌工程菌株的构建及检测步骤是： 

(1).ptsG基因的敲除 

通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655中敲除基因ptsG(磷酸转移酶系统II)。所得缺失ptsG基因的大肠杆菌MG1655ΔptsG::Cm命名为E.coli Q8。 

(2).poxB基因的敲除 

通过Red重组系统在大肠杆菌E.coli Q8中敲除基因poxB(丙酮酸氧化酶)。所得缺失poxB基因的大肠杆菌MG1655ΔptsGΔpoxB::Cm命名为E.coli Q9。 

(3).pta基因的敲除