[发明专利]一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌及其应用

权利要求书

1.一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于：该菌株命名为大肠杆菌(Escherichia coli)DT26(pBVNsS)；所述菌株已于2009年1月12日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO：M 209018。

2.根据权利要求1所述的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于：所述菌株的基因型为ΔnagE::FRT；其含有温控共表达载体即构建质粒pBVNsS。

3.根据权利要求2所述的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于：所述质粒pBVNsS是以载体pBV220为出发载体，在P_RP_L启动子下游顺序插入了N-乙酰神经氨酸醛缩酶(Neu5Ac aldolase)基因nanA和加有SD序列的N-乙酰葡萄糖胺异构酶(GlcNAc 2-epimerase)基因slr1975，具有双顺反子片段nanA-SD-slr1975。

4.根据权利要求3所述的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于：所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA来源于大肠杆菌K12 ATCC 25404。

5.根据权利要求3所述的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于：所述N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因slr1975来源于集胞藻(Synechocysits sp.)PCC6803。

6.权利要求1所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌作为催化剂在全细胞催化的制备N-乙酰神经氨酸中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌用于制备全细胞催化剂的条件为：诱导前培养温度20～35℃，诱导前培养时间0.5～5小时；以诱导温度37～45℃，诱导时间4～30小时，摇床转速150～250转/分钟，发酵罐氧溶解度15～45％的条件实施诱导，其中，经所述诱导前培养及所述诱导后收获得到的重组大肠杆菌细胞即为全细胞催化剂；使用上述全细胞催化剂制备N-乙酰神经氨酸的反应体系及反应条件是：反应体系中全细胞催化剂N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活性为20～40U，相应的N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活性为4～8U，N-乙酰葡萄糖胺浓度为200～1000mM，丙酮酸浓度为200～1500mM，磷酸缓冲液浓度40～80mM，Mg²⁺浓度10～30mM，反应体系中添加0.1～10g/L Triton X-100、0.1～10g/L SDS、0.1～10g/L CTAB或0.1～10g/L CHAPs，反应pH值为7～7.8，反应温度为25～37℃，反应时间为12～72小时，反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解度为30～70％。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌用于制备全细胞催化剂的条件为：诱导前培养温度27～32℃，诱导前培养时间1.5～2.5小时；诱导温度42～45℃，诱导时间4.5～5.5小时。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述使用上述全细胞催化剂制备N-乙酰神经氨酸的反应体系及反应条件是：反应体系中全细胞催化剂N-乙酰神经氨酸醛缩酶酶活性为27～35U，相应的N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活性为5～7U，N-乙酰葡萄糖胺浓度为800～1000mM，丙酮酸浓度为600～800mM，磷酸缓冲液浓度60～80mM，Mg²⁺浓度15～30mM，反应体系中添加浓度为0.2～0.6g/L的CTAB，反应pH值为7.2～7.4，反应温度为32～35℃，反应时间为32～60小时，反应过程控制发酵罐氧溶解度为40～70％。