[发明专利]一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，属于植物基因工程领域。

背景技术

甘薯是旋花科甘薯属的蔓生性草本植物，产量高，其块根营养丰富，淀粉含量高达12％-20％，是重要的粮食作物及工业原料。但甘薯种间、种内杂交存在不亲和性，限制了亲本的组配，而诱变育种往往效率不高且嵌合现象较为严重，因此通过遗传工程技术改良甘薯种质具有重大意义。

农杆菌是一类革兰氏阴性菌，包括根癌农杆菌(含有致瘤Ti质粒)和发根农杆菌(含致根Ri质粒)，甘薯的遗传转化主要使用根癌农杆菌。根癌农杆菌的Ti质粒含有T-DNA区，T-DNA可将携带的任何基因整合到植物基因组中，实现外源基因的导入。

根癌农杆菌介导转化的过程包括：细菌在敏感细胞上吸附，植物伤口处产生酚类物质或外源添加酚类物质激活vir基因表达，vir基因表达产物作用于T-DNA使其产生T-DNA链，进一步形成T-DNA复合体进入细胞，此复合体在胞内蛋白与细菌蛋白的共同作用下进入细胞核，而后整合入植物基因组。

自1993年Otani等人首次获得用毛状根再生的转基因甘薯植株，至今已有一些以各种甘薯外植体为受体的转基因报道，如Newell等以甘薯块根为受体获得转基因植株，Gama等以愈伤组织为受体获得转基因植株，Cipriani等以甘薯叶片为受体获得转基因植株。但与其他作物相比，甘薯的基因转化进展还比较慢，缺乏高效的遗传转化及再生体系，获得的转基因植株比较少(基本只局限在几个品种)。因此，甘薯的转基因体系有待改进。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法，建立了一个适合多个甘薯品种的不定芽发生体系，从而有效地克服了基因型对甘薯遗传转化的限制，使绝大多数基因型的甘薯都能够发生不定芽。此法取材不受季节限制，转化频率较高，且再生植株无性系变异较小。

本发明所述农杆菌介导的甘薯不定芽转化方法包括无菌苗快繁，以甘薯茎段为受体的遗传转化，不定芽再生及小苗生根，抗生素筛选和小苗移栽等步骤，具体是：

(1)无菌苗的获得及培养

将甘薯植株距地面10厘米以上部分剪下，用自来水冲洗30分钟，剪去叶片将茎切成2cm左右小段，用70％乙醇消毒1分钟，去净乙醇后用0.1％HgCl₂消毒10分钟，无菌水冲洗4遍，无菌滤纸吸去水分后将茎段放入固体培养基上，在22℃-25℃下光照培养。其中所述固体培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(2)甘薯茎段的预培养

将培养20-30天的甘薯无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5-1厘米的小段(每段含1-2个节)，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽。经过上述处理的甘薯茎段切面向下置于固体培养基上，22℃-25℃下暗培养3天。其中所述固体培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(3)菌株的活化及菌液的制备

将4℃保存的带有植物表达载体的农杆菌在添加了50mg/L利福平的YEP固体培养基上划线，28℃黑暗培养3天后挑取单菌落，接入含有50mg/L利福平的YEP液体培养基，黑暗下28℃、200r/min振荡培养24小时后再次转接，相同条件下培养16小时。将菌液置于灭菌的离心管中，8000rpm离心5分钟收集菌体，用5％蔗糖溶液重悬菌体，调整至OD600值为0.6-1.0，备用。

(4)农杆菌侵染和共培养

将预培养过的甘薯茎段浸入步骤(3)的农杆菌菌液中，侵染10-15分钟。将茎段取出，用无菌滤纸吸去多余菌液，切面朝下置于继代培养基上，23℃-25℃下暗培养5天。其中所述继代培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。

(5)农杆菌脱菌及不定芽再生

将共培养后的组织块用无菌水清洗3-4次，再用无菌滤纸吸干，转接至不定芽诱导培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14小时条件下，连续培养20±2天，分化出不定芽。其中所述不定芽诱导培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L KT(激动素)+0.01-0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8，并添加200mg/L头孢噻肟钠抑制农杆菌生长。

(6)甘薯小芽的分割及生根