[发明专利]对虾白斑症病毒免疫检测芯片及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种对虾白斑症病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征是它包括如下步骤：

   （1）抗体的制备及纯化              

    制备兔抗白斑症病毒抗体，兔抗鼠Ig的抗体，鼠抗白斑症病毒单克隆抗体，亲和层析法纯化所得抗体；

   （2）Cy3标记单克隆抗体探针的制备

将亲和层析纯化后的鼠抗白斑病毒单抗用Cy3标记，并过凝胶柱纯化；

   （3）载玻片的预处理

将载玻片分别用强碱和浓硫酸浸洗，双蒸水冲洗，晾干；将清洗后的载玻片浸入0.4％的亲和硅烷的乙酸溶液中，调pH至4.5，室温下作用1h，双蒸水冲洗，晾干；

   （4）琼脂糖凝胶基片的制备

配制0.6～1.4％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min，使其完全溶解，将2ml琼脂糖溶液铺覆在经60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁载玻片上；待琼脂糖凝固后，将玻片在37℃下过夜干燥；使用前在室温下用0.02mol/L NaIO₄溶液活化30min，超纯水冲洗3遍，用氮气流吹干，室温干燥处保存；

   （5）抗体的固定

① 用pH 7.4的含10%～60%甘油的PBS缓冲液稀释兔抗白斑症病毒抗体，使其浓度为0.5～0.0001mg/mL、稀释兔抗鼠Ig的抗体，使其浓度为0.1mg/mL；

② 用点样仪将此抗体稀释液在琼脂糖凝胶基片的不同区域点样，点样量为50～70nL，点直径为500～600μm；每张芯片两排四列共8个4×4亚阵列，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为兔抗白斑症病毒抗体，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照；各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元；37℃饱和湿度放置0.5~2.5h，洗涤，晾干；

③向载玻片上点有抗体的区域滴加1～5％牛血清白蛋白，或5％脱脂奶粉，或1％明胶，或甘氨酸，或谷氨酸，或酪氨酸进行封闭，37℃饱和湿度放置0.25～2h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到对虾白斑症病毒免疫检测芯片。

2.根据权利要求1所述的对虾白斑症病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征在于用Cy3标记亲和层析纯化后的鼠抗白斑症病毒单抗作为抗体探针，并使用兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。

3.根据权利要求1所述的对虾白斑症病毒免疫检测芯片的制备方法，其特征在于Cy3标记的抗体探针所用单抗是由两株杂交瘤细胞分别分泌的鼠抗白斑症病毒核衣壳单抗D和鼠抗白斑症病毒囊膜单抗E。