[发明专利]一种现场检测免疫芯片及其制备方法与应用

权利要求书

1、一种现场检测免疫芯片，其特征在于包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的琼脂糖凝胶层，琼脂糖凝胶层上固定多个抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen划线隔开；所述的芯片载体为标准载玻片，芯片载体具有经过亲和硅烷处理后，并用琼脂糖凝胶修饰的玻璃表面，该表面经NaIO₄活化后，使抗体以物理吸附和共价连接两种方式固定在其上。

2、根据权利要求1所述的现场检测免疫芯片，其特征在于所述的抗体是兔抗白斑症病毒(WSSV)抗体或兔抗淋巴囊肿病毒(LCDV)抗体及兔抗鼠Ig的抗体。

3、根据权利要求1所述的现场检测免疫芯片的制备方法，其特征是它包括如下步骤：

(1)抗体的制备及纯化

制备兔抗WSSV抗体、兔抗LCDV抗体、鼠抗WSSV单克隆抗体(单抗)、鼠抗LCDV单抗及兔抗鼠Ig的抗体，亲和层析法纯化所得抗体；

(2)HRP标记单克隆抗体探针的制备

将亲和层析纯化后的单抗(鼠抗WSSV单抗、鼠抗LCDV单抗)用HRP标记，并过凝胶柱纯化；

(3)琼脂糖凝胶基片的制备

将清洗后的载玻片浸入0.4％的亲和硅烷的乙酸溶液中，调pH至4.5，室温下作用1h，双蒸水冲洗，晾干；配制1.2％的琼脂糖溶液，微波炉煮沸3min，使其完全溶解，将2ml琼脂糖溶液铺覆在经60℃预热的亲和硅烷处理过的清洁载玻片上；待琼脂糖凝固后，将玻片在37℃下过夜干燥；使用前在室温下用0.02mol/L NaIO₄溶液活化30min，超纯水冲洗3遍，用氮气流吹干，室温干燥处保存；

(4)抗体的固定

将捕获抗体(兔抗WSSV抗体或兔抗LCDV抗体、兔抗鼠Ig的抗体)用含50％甘油的PBS稀释至合适浓度，用点样仪在上述琼脂糖修饰的玻片表面点样，每张芯片两排四列共8个4×4矩阵，每个亚阵列所点样品一致，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二、三列所点样品为捕获抗体，为病原检测点，第四列为质量控制点，所点样品为兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。各个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元；37℃饱和湿度放置2h，洗涤，晾干；

向载玻片上点有抗体的区域滴加3％牛血清白蛋白封闭，37℃饱和湿度放置1h，洗涤，晾干，4℃密封保存，得到所述现场检测免疫芯片。

4、根据权利要求3所述的现场检测免疫芯片的制备方法，其特征在于用HRP标记亲和层析纯化后的高特异性的单抗(鼠抗WSSV单抗、鼠抗LCDV单抗)作为抗体探针，并使用兔抗鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照。

5、根据权利要求3所述的现场检测免疫芯片的制备方法，其特征在于所述鼠抗WSSV单抗为保藏号分别为CCTCC-C200422和CCTCC-C200421的杂交瘤细胞分泌的鼠抗WSSV核衣壳单抗D和抗WSSV囊膜单抗E；鼠抗LCDV单抗为保藏号分别为CCTCC-C200419和CCTCC-C200420的杂交瘤细胞分泌的LCDV单抗B和单抗C。

6、根据权利要求1所述的现场检测免疫芯片在水产动物病毒检测中的应用。