[发明专利]鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及海水养殖动物病原检测技术的改进，具体涉及一种用于检测鱼类淋巴囊 肿病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)的免疫检测芯片或微阵列及其制备方法 与应用，其属于免疫学、病毒学及生物芯片交叉技术领域。

背景技术

鱼类淋巴囊肿病是一种慢性病毒病，患病鱼的表皮、鳍和尾部等处出现菜花样囊肿， 影响其商品价值或导致鱼死亡。淋巴囊肿病的病原为淋巴囊肿病毒(LCDV)，属于虹彩 病毒科(Iridoviridae)。淋巴囊肿病流行地区较广，呈世界性分布，目前已知至少42科 125种以上的海水、咸水和半咸水鱼类可被LCDV感染。自1997年牙鲆淋巴囊肿病在我 国首次大规模暴发以来，我国山东、河北、广东、浙江等省养殖的石斑鱼、真鲷、美国红 鱼、许氏平鲉、军曹鱼等均发生过此病，造成的直接和间接经济损失达百亿元之巨。与 其他的病毒病一样，鱼类淋巴囊肿病毒病缺乏有效的治疗药物。LCDV感染具有潜伏期长 的特点，使LCDV极易随着亲鱼与鱼苗在不同地区间的交流而传播，因此，养殖生产中 急需LCDV的快速准确检测技术，以期达到早发现早预防的目的。

国内外检测鱼类病毒的方法大致包括电镜技术，PCR法，DNA探针原位杂交法，免 疫荧光抗体技术，免疫组织化学技术，酶联免疫吸附检测法以及斑点免疫印迹技术等。 但这些检测技术局限性大，灵敏度、特异性、准确性多不能兼顾，不能用于多样品同时 并行检测。因此，建立一种适用于鱼类淋巴囊肿病毒的简便、快速、准确、多样品并行 处理的检测诊断技术势在必行，而新发展起来的蛋白芯片技术为其提供了强有力的技术 平台，微量化的反应既可节约昂贵的试剂又可结合动力学的快速分析，在蛋白质水平上 提供了一个廉价快速的测试手段，在诊断领域具有相当广阔的应用前景。另外，鱼类淋 巴囊肿病毒单克隆抗体的成功研制，为利用单克隆抗体建立鱼类淋巴囊肿病的免疫芯片 检测诊断技术奠定了基础。

发明内容

针对上述现状，本发明的目的是提供一种能同时检测多种样品或同一样品不同组织 中淋巴囊肿病毒的免疫检测芯片，用于海水养殖鱼类中LCDV的快速、灵敏、准确的检 测，以及进出口鱼类中LCDV的检疫。

本发明的另一个目的是提供上述鱼类LCDV免疫检测芯片的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述免疫检测芯片在养殖鱼类LCDV检测中的应用。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片，其结构包括芯片载体、铺覆于芯片载体上的 琼脂糖凝胶层、琼脂糖凝胶层上固定有多个抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围 栏或Super PAP Pen划线隔开。A液：渗透压小于360mOsm/kg的低渗液；B液：吐温- 磷酸盐缓冲液(PBST)；C液：Cy3标记的鼠抗LCDV的单克隆抗体(单抗)探针， 探针所用单抗是由两株杂交瘤细胞分别分泌的特异性抗LCDV单抗(简称：LCDV单抗 B和单抗C)，杂交瘤细胞的保藏号分别为：CCTCC-C200419和CCTCC-C200420，保 藏日期：2004年12月14日。LCDV与该两株单抗发生特异性结合的抗原决定簇位于病 毒囊膜上。

本发明以现有技术的实际特点：其一，鱼类体内有免疫球蛋白-IgM的形成，但血 清中IgM的标记程序较为复杂；其二，对海水养殖动物疾病的诊断是一个群体的概念， 可以通过对多个个体的检测达到对群体做出诊断的目的。因此，本发明根据这些特点， 采用夹心法检测抗原，在芯片片基上固定病原的抗体，取待检个体病毒靶器官制备待检 样品液，直接将待测样品液与固定有病原抗体的芯片孵育，再加荧光标记的特异性单抗 探针，通过CCD扫描仪读取结果。

鱼类淋巴囊肿病毒免疫检测芯片的制备方法，包括如下步骤：

(1)抗体的制备及纯化

从患淋巴囊肿病的牙鲆体表肿瘤中提取LCDV，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采 血制备血清，得到兔抗LCDV抗体。

复苏并培养小鼠杂交瘤细胞株(LCDV单抗B和单抗C)，注射一定数量的杂交瘤细 胞入小鼠腹腔生产腹水，得到大量高浓度、高特异性、高效价的鼠抗LCDV单抗。

取亲和层析纯化后的LCDV单抗B和单抗C，常规方法免疫纯种新西兰白兔，采血 制备血清，得到兔抗鼠抗LCDV单抗的抗体(兔抗鼠Ig的抗体)。