[发明专利]利用pre-miR159a构建的抗病毒植物表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及了一种采用拟南芥pre-miR159a的克隆、改造、转化以及转基因制得的抗病毒载体。

背景技术

植物病毒病是农作物的主要病害，目前约有1000多种植物病毒病已被人们所认识。每年全世界的农作物因病毒侵害的损失高达200亿美元，对农业生产构成了严重的威胁。因此，植物病毒病的防治早已是农业工作者关注和研究的重要对象。早期对病毒病的防治措施主要是栽培管理和传统的抗病育种。通过改善栽培管理来增强植物的抗病性，这一措施只能是减轻植物的发病程度但不能从根本上解决植物病毒发生的问题；而传统的抗病育种由于育种周期长，加之绝大多数植物缺少抗病毒基因或植物对某一病毒的抗性是一种多基因效应，很难通过传统育种的方式获得抗病毒植株，因此，通过传统的育种方法来防治植物病毒病已远远无法满足人们的要求。近年来，植物分子生物学和基因工程技术的发展给植物病毒病的抗病育种开辟了新途径。利用病毒本身的一些基因或经改造合成的基因转入受体植物中去，可获得抗病毒的转基因植株。最早获得成功的是使用病毒外壳蛋白基因(CP)，这一策略是使转CP基因在植株内表达，干扰病毒的正常增殖环节，从而达到抗病目的。此外，利用病毒的复制酶基因、运动蛋白基因转化植物也是植物抗病毒基因工程的重要策略，并已成功地应用于一些病毒病的防治中。早期的研究大多是通过表达病毒的蛋白质来实现抗病的，转基因序列表达蛋白量的多少直接影响着抗性水平的高低，因此这类抗性常称作蛋白质介导的抗性。其主要特征是抗性水平与转基因的蛋白质表达量成正相关。但是，随着研究的深入，与蛋白质介导的抗性特点相背的例子逐渐增多，甚至在无翻译起始密码子的情况下，转基因仍可以赋予植物抗性，这是不同于蛋白质介导抗性的另一种抗病类型，即RNA介导的病毒抗性。

在植物抗病毒基因工程育种中，RNA介导的病毒抗性是同源依赖的抗性，即转入的病毒基因在细胞核内正常转录或高水平转录，转基因mRNA转运到细胞质后与同源的入侵病毒核酸发生碱基互补，形成双链核酸，然后被寄主内的核酸酶所降解，转基因发生了RNA沉默，而入侵病毒则不能进一步复制，从而赋予转基因植物对特异病毒的抗性。在这一过程中转基因植物发生的RNA沉默是由于病毒入侵转基因植物所导致的，因此又称这类RNA沉默为病毒诱导的RNA沉默。另一种是在没有病毒侵染的情况下转入的病毒基因发生了RNA沉默，即由于转基因插入方式的不同、转基因高拷贝的存在、转基因插入位点等造成了转基因高水平转录，形成了大量异常RNA，这些异常RNA很容易被寄主内的RNA依赖的RNA聚合酶所识别，然后以异常RNA为模板，转录形成双链RNA，进一步被寄主体内的核酸酶降解，转基因发生了RNA沉默。当同源的病毒入侵时，病毒的核酸被细胞内已经发生的RNA沉默机制所降解，病毒不能复制，转基因植物表现为对特异病毒的抗性。这类RNA沉默称之为转基因诱导的RNA沉默。研究发现，无论是病毒诱导的RNA沉默还是转基因诱导的RNA沉默，直接导致RNA沉默发生的是小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)。因此，将上述两类RNA沉默介导的病毒抗性统称为siRNA参与的RNA沉默介导的病毒抗性。在植物抗病毒工程中这一策略得到了广泛地运用，获得了大量抗病毒的转基因植物。但是，随着研究的深入人们发现这一策略存在着一些弊端，主要体现在三个方面：第一，siRNA的产生和传播受寄主植物内一些酶活性、环境温度的变化和病毒抑制子等相关因素的影响。如这类转基因植物的病毒抗性往往因温度的降低而抗病性丧失、能产生沉默抑制子的病毒入侵，通过抑制RNA沉默而打破了转基因植株的抗病性。第二，这一策略需要完整的病毒基因或较长的病毒cDNA片断，而长片断在植物中如果没有足够大的同源性则容易造成脱靶，不会发生RNA沉默，转基因植物就不会产生抗病毒作用。第三，转入长的病毒cDNA片断存在着与其他入侵病毒或寄主植物的基因组发生重组的风险，转基因植物的安全性得到一定程度的质疑。因此，在目前研究的基础上很有必要探讨更有效的植物抗病毒育种新策略。