[发明专利]鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。

背景技术

鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)是一种革兰氏阴性杆状细菌，是淡水和海水养殖鱼类和野生鱼类的病原菌，引起鱼类的出血性败血症，造成世界范围鱼类养殖的重大经济损失。在我国，鳗利斯顿氏菌不仅是养殖对虾红腿病症的病原，还是鲈鱼、牙鲆、大菱鲆、石斑鱼和欧洲鳗鲡等鱼类的皮肤肌肉溃烂、出血症病原，对我国养殖鱼类的危害巨大。

VI型分泌系统(Type VI Secret System，T6SS)是最近确定的一种新的细菌分泌系统，它参与细菌的致病作用，并已经在多个植物或动物的病原菌中发现。目前的研究表明，革兰氏阴性细菌的T6SS基因簇结构比较保守，一般由12至25个基因组成，其中包括一个基质蛋白基因hcp。hcp基因在不同细菌中具有较高的保守性，它编码的蛋白在T6SS的分泌过程中具有重要作用，研究表明它可能作为T6SS的基质蛋白参与组装分泌通道，hcp基因的缺失可以阻断T6SS的分泌。但目前还没有关于HCP蛋白具有免疫保护效果的文献报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白：鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸碱基序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白即为鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO：2所示。

鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白的应用：所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白具有激发鱼体对鳗利斯顿氏菌病的免疫力。

将所述鳗利斯顿氏菌亚单位疫苗抗原蛋白与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂，按体积1∶1比例将其混合，而后以20μg蛋白/g鱼体重～0.2μg蛋白/g鱼体重的接种剂量，腹腔注射于鱼体。

本发明所具有优点如下：

1.hcp基因在细菌中的保守性较高，本发明以lahcp基因的表达蛋白制备的亚单位疫苗可以拓宽疫苗保护谱、增加疫苗的免疫协同作用，诱导水产养殖动物的非特异性和特异性免疫应答，并提供保护效应。

2.本发明表达蛋白可激发鱼体产生特异性抗体，抵抗鳗利斯顿氏菌的感染，可用于水产鱼类养殖中鳗利斯顿氏菌引起疾病的预防中。

3.本发明的抗原蛋白制备方法简单，可应用于大规模工业化生产。

附图说明

图1为本发明鳗利斯顿氏菌lahcp基因核酸电泳图。

图2为本发明鳗利斯顿氏菌LAHCP表达纯化蛋白SDS-PAGE电泳图。

图3为本发明鳗利斯顿氏菌LAHCP表达纯化蛋白质谱分析结果。

图4为使用本发明疫苗免疫牙鲆后鳗利斯顿氏菌感染牙鲆死亡情况图。

图5为使用本发明疫苗免疫蓝鳗龙后鳗利斯顿氏菌感染蓝鳗龙死亡情况图。为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆血清抗鳗利斯顿氏菌抗体效价变化情况图。

图6为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆血清抗LAHCP抗体效价变化情况图。

具体实施方式

下面根据附图说明和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

根据鳗利斯顿氏菌T6SS基质蛋白基因lahcp的核酸序列，以及载体pETDuet(购自Novagen公司)的酶切图谱设计扩增引物：

lahcp-for-EcoRI：5’-GGCGAATTCATGCCAACTGCATG-3’(下划线碱基序列为限制性内切酶EcoRI的识别位点)；

lahcp-rev-SalI：5’-ATCGGTCGACTTACGCTTCAACAG3’(下划线碱基序列为限制性内切酶SalI的识别位点)。

以鳗利斯顿氏菌基因组DNA为模板进行PCR扩增反应(PCR仪购自Takara公司，型号TP600)，反应体系与反应参数如下：(试剂尽量用中文表示)

PCR反应体系(25μL)

10×PCR buffer        2.5μL

dNTP混合液            0.5μL(各0.2mM)

MgCl₂                 2.0μL(1.5mM)

引物lahcp-for-EcoRI   0.5μL(0.5μM)

引物lahcp-rev-SalI    0.5μL(0.5μM)

鳗利斯顿氏菌基因组DNA 1.0μL(30ng)