[发明专利]一种蜡状芽孢杆菌菌株及用它制备的拟除虫菊酯类农药的降解酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蜡状芽孢杆菌菌株，尤其是一种茶树内生、可高效降解拟除虫菊酯类农药的蜡状芽孢杆菌菌株，还涉及用它制备的拟除虫菊酯类农药的降解酶及其制备方法。属于微生物技术领域。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高和健康意识的增强，绿色食品越来越受到人们的青睐。茶叶是一种天然保健饮品，并被称誉为21世纪的健康饮料，当今全球有近半数人饮茶。然而由于病虫害的直接或间接危害，对提高茶叶经济效益造成了一定的负面影响。茶叶是以嫩梢为主要收获物的经济作物，传统的化学防治方法给茶叶产品带来农残超标、生态系统恶化等严重问题。我国每年由于农药残留超标被退回或销毁的茶叶就有上万吨，损失巨大。

目前，化学农药仍是作物病虫害防治的主体，但它造成了农药残留、环境污染、有害生物抗药性产生、非靶标生物受害，乃至生态平衡受破坏等重大问题。即使是拟除虫菊酯类农药低毒、杀虫谱广，也存在着降解速度慢等问题，对生态环境同样会产生一定的影响。联合国粮农组织和世界卫生组织已对它们在农产品中的残留限量作出了严格的规定。微生物降解农药的研究一直是国内外的研究热点，至今已取得了很大进展，表现在降解农药的微生物种类不断被发现，降解机理日趋深入，降解效果稳定提高等方面。拟除虫菊酯类降解菌主要有假单胞菌(Pseudom onas spp.)、芽孢杆菌(Bacillusspp.)和产碱菌属(A lcaligenes spp.)等。人们研究发现，生长在不同污染环境中的植物能选择性地增加含有污染物降解基因的内生细菌。

微生物对农药的降解研究始于40年代末，一直是国内外的研究热点，至今已取得了很大进展。微生物对农药的作用方式多样，多数属于通过酶促反应降解农药。农药的酶促反应主要是由微生物的胞内酶引起的：将农药吸附于微生物细胞表面；农药穿透细胞膜进入膜内；农药在细胞膜内通过与降解酶结合发生酶促反应。农药降解酶在农药残留降解的应用中，具有降解效率高、作用底物浓度低、降解谱广、安全无毒、环境适应强等优点，具有良好的应用前景。目前生物农药的研发远不能满足无公害茶园防治病虫害的需要，而国内外对直接应用内生细菌防治茶树病害的研究很少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种枯草芽孢杆菌菌株，其为茶树内生农药降解菌，以便高效能的降解拟除虫菊酯类农药。所要解决的技术问题之二是，提供一种从菌株中制备出拟除虫菊酯类农药降解酶的方法，并且制备出降解酶。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是，一株蜡状芽孢杆菌TR2(Bacillus cereus TR2)菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M209001。

上述的蜡状芽孢杆菌TR2(Bacillus cereus TR2)菌株，其为从茶树体内分离得到，其菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，周生鞭毛，椭圆形芽孢，兼性厌氧，在平板上长成的菌落初为乳白色、圆形、边缘整齐、略凸起、表面湿润、半透明、略粘稠，后期为灰白色、近圆形、边缘波浪状、凸起呈乳头状或中央凹陷、表面干燥、不透明、粘稠。其能在茶树体内内生、对茶轮斑病防病效果好以及对拟除虫菊酯类农药降解效能高。

本发明采取的技术方案之二是，一种从上述菌株中制备拟除虫菊酯类农药降解酶的方法，包括下列内容：

1、将TR2菌株的新鲜培养物接种于添加50mg/L氯氰菊酯的基础培养基中，37℃、180r/min下培养72h。

2、将培养液7500r/min离心10min，分别得上清液和菌体。

3、将菌体用0.02mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，按3ml缓冲液+1g菌体的比例配成菌悬液。

4、将菌悬液置于冰浴中超声波破碎处理7次，每次50s。

5、然后，10000r/min离心10min，取上清液，得胞内粗酶液，即为拟除虫菊酯类农药降解酶。

上述的方法中，其破碎菌体所用机械为JY92-II型超声波细胞粉碎机(200W)。

一种拟除虫菊酯类农药降解酶，以蜡状芽孢杆菌TR2菌株(CCTCC NO：M209001)为出发菌株，应用上述的制备方法制得。