[发明专利]一种血清中MG7-Ag的定量检测方法

权利要求书

1、一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)包被：将ELISA板孔分为标准品孔、检测样品孔；标准品孔：加入梯度浓度稀释的MG7-Ag的标准品，每孔100μl；检测样品孔：加入90μl待测血清及10μl的10倍稀释的包被缓冲液，混匀；ELISA板孔4℃过夜，弃去液体，PBS-T液洗涤；

2)封闭：每孔加入5mg/ml BSA的封闭液，37℃孵育1h，PBS-T液洗涤；

3)抗原抗体反应：每孔加入100μl MG7抗体，37℃孵育1h，PBS-T液洗涤；

4)二抗反应：每孔加入100μl的生物素化的抗鼠源性二抗，37℃孵育1h，PBS-T液洗涤；

5)链亲和素结合：每孔加入100μl的链亲和素，37℃孵育45min，PBS-T液洗涤；

6)生物素化DNA报告分子结合：每孔加入30μl的生物素化DNA，37℃孵育1h，PBS-T液洗涤；

7)实时荧光定量PCR反应：以每孔所得生物素化DNA为模板分别进行实时荧光定量PCR反应，其中PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸30s；35～40个循环结束后于72℃延伸10分钟，以PCR扩增生物素化DNA的Tm温度处读取荧光检测量，得到每孔对应的PCR扩增曲线；

8)确定检测样品的循环数：根据检测样品孔对应的一组PCR扩增曲线，得到每孔检测样品达到所述荧光检测阈值处的循环数；

9)绘制标准曲线：根据每个标准品孔的标准品浓度和其达到荧光检测阈值的循环数的对应关系，建立标准曲线；

10)确定检测样品的MG7-Ag含量：根据标准曲线，按照每孔检测样品的循环数确定其MG7-Ag含量。

2、如权利要求1所述的一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，所述的生物素化DNA是生物素标记的非特异性序列DNA。

3、如权利要求1所述的一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，所设定的荧光检测阈值处于PCR扩增曲线的指数阶段。

4、如权利要求1所述的一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，所述标准品为纯化的MG7-Ag。

5、如权利要求1所述的一种血清中MG7-Ag的定量检测方法，其特征在于，所述标准品为表面表达MG7-Ag的胃癌细胞的裂解液。