[发明专利]一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar

说明书

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物工程细胞悬浮适应-可贴壁性细胞亚群；特别是一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar及应用，可以适用于规模化瞬时转染和无载体化细胞团培养生产重组腺病毒载体和重组蛋白。 

背景技术

目前常用的工程细胞如HEK293、CHO、BHK等，在悬浮培养时一般均会发生凋亡或者周期抑制。工程上常采用悬浮适应方法进行贴壁细胞的悬浮驯化，以获得适应大规模悬浮培养的适应性细胞，因为只有悬浮培养方法更有利于工业规模化培养。动物工程细胞的悬浮适应过程一般经过长达数月乃至成年的反复贴壁和悬浮培养循环才能获得一种悬浮培养特性不太稳定的悬浮适应的细胞亚群，因为在实验室我们常会观察到悬浮细胞悬浮特性退化而导致重新贴壁培养的现象。分析悬浮适应方法的具体过程可以看出，这种方式是以是否具有悬浮特性作为标准筛选细胞群的，没有考虑到此筛选方法是否有利于高效外源蛋白表达细胞亚群的获得，在此过程中，有可能把具有高活性表达外源蛋白的细胞克隆丢掉；另外，这种方法获得悬浮适应细胞亚群一般耗时、耗力，而且即使获得带有外源表达特性的细胞株，也难于对其进行进一步的遗传改造或基因转染，因为在悬浮条件下进行基因操作的效率都很低，比如目前适应于药物开发前期需要的大规模瞬时转染在悬浮条件下转染效率非常不理想。 

人胚肾293细胞系是用于制备重组腺病毒载体和重组蛋白的主要生产工程细胞。利用HEK293细胞悬浮培养时具有成团的培养特性，可以采用沉降或过滤的技术手段，使HEK293细胞团截留在搅拌培养体系中，起到类似于微载体和/或多孔微载体固定化培养的目的，并结合动物细胞培养过程的动态检测和优化控制，实现HEK293细胞的高密度长期培养及其表达产品的高效生产。悬浮细胞团中的细胞间所形成紧密的相互联系和相互作用有利于细胞表型的表达和维持，这一理论推断在一些研究中已经得到证实。利用HEK293细胞建立大规模瞬时转染生产药物蛋白生产模式，有可能建立高效的大规模瞬时转染工艺。但据Sabine Geisse报道，虽然理论上利用PEI(聚乙烯亚胺)转染细胞可以达到83％的转染效率，但由于目前商业上使用的无血清培养基中含有转染抑制剂而导致这样的转染效率难以达到。在商业培养基配方还属于专利保护范围的情况下，有必要发展形成一种更好的瞬时转染策略。基于贴壁培养条件 下细胞转染效率高和悬浮条件下蛋白生产有优势的特点，我们尝试建立一种先行在贴壁培养下进行转染，然后在悬浮条件下以无载体固定化培养方式进行规模化生产蛋白药物的策略。而这一策略的关键是要克服贴壁依赖性动物工程细胞在胞外基质剥夺时要发生失巢凋亡的特性，比如HEK293、CHO等。 

研究表明，哺乳动物细胞系实质上是由一群对失巢敏感程度不同的多个细胞亚群组成的细胞群。动物工程细胞的悬浮驯化过程其实就是将亲本细胞群在反复的贴壁和悬浮培养过程中逐渐分群的过程；在此过程中，失巢敏感细胞由于发生失巢凋亡而逐渐被筛掉，而具有失巢凋亡抗性的细胞亚群会在此培养过程中逐渐被富集，最终形成一群具有失巢凋亡抗性适应悬浮培养的细胞亚群，即形成悬浮适应细胞亚群。然而，工程贴壁细胞在经过悬浮适应驯化以后，细胞在贴壁条件下培养的贴壁性能会有所下降，即使在贴壁条件下培养很长时间也很难重新贴壁。在利用动物哺乳细胞大规模瞬时转染方法生产蛋白药物时，目前多采用悬浮培养的细胞进行大规模瞬时转染，但由于在转染过程中细胞处于悬浮状态导致和转染物质的接触几率很小，从而使得转染和蛋白生产效率很低，严重影响此生产方式的进一步的规模化和生产化。如果在转染过程中使用的工程细胞既能以悬浮细胞团的形式生长，又具有在贴壁条件下重新贴壁的性能，那么我们就可以利用此细胞先在贴壁条件下进行高效率瞬时转染，继而在悬浮培养条件下培养生产蛋白药物；而且，在工程上细胞以细胞团为生命存活形式是一种典型的细胞自固定化方式，有利于细胞抵御不良环境影响，还有利于细胞活性的保持和外源蛋白的表达。正是基于以上假设，本发明参照肿瘤细胞在侵袭转移过程中侵袭转移能力即失巢凋亡抗性获得的生命历程，在体外通过贴壁和悬浮培养的反复筛选，获得了具有失巢凋亡抗性(即悬浮适应)培养特性，又具有在贴壁培养条件下重新贴壁性能的特殊细胞亚群。 

我们选择以HEK293细胞作为本发明的哺乳工程细胞生产细胞群，因为此细胞即是大规模生产重组腺病毒载体和重组蛋白中常用的细胞株，又是近年来进行大规模瞬时转染法生产药物蛋白的最常用细胞株。 

发明内容