[发明专利]耐热菌的ELISA快速检测方法

权利要求书

1.耐热菌的ELISA快速检测方法，其特征是按以下操作步骤进行：

a耐热菌的捕集

a.1取10-20g待检苹果浓缩汁，以无菌水适度稀释，

a.2用溶剂过滤器过滤捕集耐热菌，滤膜孔径0.45μm，

a.3耐热菌被截留于滤膜表面；

b耐热菌预增菌

b.1采用402培养基预增菌14-15h，

b.2将增菌后的培养液以10000-12000rpm/min，离心10-15min；

c耐热菌包被酶标板

c.1用0.05mol/L、pH9.6的碳酸缓冲液制成菌悬液作为包被液，

c.2将包被液均匀加到酶标板中，每孔100-150μL，

c.3酶标板在55-60℃烘箱中2-3h烘干，

c.4用0.01mol/L，pH7.4的PBS-吐温20洗板，

c.5每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次，

c.6洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；

d封闭酶标板

d.1封闭液为5％-8％的脱脂奶粉，

d.2将封闭液均匀的加到酶标板各孔中，每孔200-300μL，

d.3在37℃温箱中孵育2-3h，

d.4洗板

d.4.1用0.01mol/L、pH7.4的PBS-吐温20洗板，

d.4.2每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次，

d.4.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；

e加耐热菌多克隆抗体

e.1耐热菌多克隆抗体为免疫大白兔得到的多克隆抗体，

e.2免疫程序为：

e.2.1给大白兔耳静脉注射耐热菌，注射的耐热菌浓度为1×10⁸-1 ×10⁹个/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量为0.5mL， 以后每次注射量比上一次增加0.5mL，

e.2.2免疫注射6次后，于第22-25天取血，分离血清即为耐热菌多 克隆抗血清，

e.2.3将耐热菌多克隆抗血清经过盐析、DEAE-纤维素层析纯化即得耐 热菌多克隆抗体，

e.3耐热菌多克隆抗体与PBS-吐温20的稀释比例为1∶1600，

e.4将稀释的耐热菌多克隆抗体加到酶标板各孔中，每孔100-150μL，

e.5在37℃温箱中孵育1-2h，

e.6洗板

e.6.1用0.01mol/L、pH7.4的PBS-吐温20洗板，

e.6.2每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次，

e.6.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；

f加酶标抗体

f.1酶标抗体为酶标山羊抗兔抗体，

f.2酶标抗体与PBS-吐温20的稀释比例为1∶20000，

f.3将稀释的酶标抗体加到酶标板各孔中，每孔加100-150μL，

f.437℃温箱中孵育1-2h，

f.5洗板

f.5.1用0.01mol/L，pH7.4的PBS-吐温20洗板，

f.5.2每隔1分钟洗板一次，共洗板5-6次，

f.5.3洗完之后，倒扣酶标板，轻轻拍掉悬浮液珠；

g加底物工作液

g.1底物工作液配方如下：

g.1.1取25.7mL 0.2mol/L Na2HPO4和24.3mL 0.1mol/L柠檬酸液放入 100mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度即为底物缓冲液，

g.1.2精确称取0.02g 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺粉末，溶于20mL无 水乙醇，即为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺母液，

g.1.3底物缓冲液与3，3’，5，5’-四甲基联苯胺母液按1∶1的比例混 合，每毫升混合液再加入2μL 30％H₂O₂即为底物工作液，

g.2将底物工作液加到酶标板各孔中，每孔加100-150μL，

g.3反应15-20min，

g.4加终止液终止反应，

g.4.1终止液为2mol/L的硫酸，

g.4.2酶标板每孔各加50-75μL；

h酶标仪测定

h.1将终止反应的酶标板放入酶标仪，

h.2在波长为450nm处测定0D值，

h.3以(样品孔0D值-阴性孔OD值)/阴性孔0D值≧2.1为阳性判断 标准，

h.3.1样品孔为加经捕集并经预增菌处理的样品液，以及耐热菌多克 隆抗体、酶标抗体、底物工作液及终止液的酶标孔，

h.3.2阳性样为加耐热菌抗原，以及耐热菌多克隆抗体、酶标抗体、 底物工作液及终止液的酶标孔，

h.3.3阴性孔为不加耐热菌抗原，而加耐热菌多克隆抗体、酶标抗体、 底物工作液及终止液的酶标孔。